蚊子唾液SGS1蛋白天然结构揭示与病原体

渔夫说。

蚊子在吸血时会把唾液注入脊椎动物体内，这样会传播人类病原体，每年导致约万人死亡。

蚊子唾液腺中分泌的最丰富和最保守的蛋白质是SGS1，它有助于病原体传播。

我们用冷冻的方法确定了SGS1的天然结构，发现含有个氨基酸的这种蛋白，有着类似Tc毒素的Rhs/YD外壳、四个受体结构域，以及一组C端雏菊链螺旋。

这些螺旋部分被包在Rhs/YD壳内，要转成预测的跨膜螺旋，这种转化，还有SGS1表面的很多受体结构域，可能是让孢子虫/虫状病毒侵入唾液腺、操控宿主免疫反应的关键。

埃及伊蚊、库蚊和冈比亚按蚊，是主要传播蚊媒病原体的蚊子，这些病原体包括节肢动物传播的（虫媒）病毒，如登革热、黄热病、寨卡病毒和基孔肯雅病毒，还有引起疟疾的寄生虫恶性疟原虫。

现在，每年差不多有万人因病媒传播的疾病而去世。要是被感染的雌蚊子在吸脊椎动物的血时，把唾液注入到宿主体内，病原体就会在这过程中被传播。

分析蚊子唾液成分可知，唾液分子有抗凝血和免疫调节的特性，这与蚊子吸血获取营养有关，相关研究通过了转录、蛋白质组学和功能研究。

通过蚊虫叮咬感染虫媒病毒比仅通过针头注射传播病毒更严重，蚊子的唾液还能提高恶性疟原虫的传染性，加快疟疾的病程。

蚊子唾液里可能有到种蛋白质，其中30%到40%属于从未鉴定过的蛋白质家族。

埃及伊蚊的唾液中，有一种含量颇丰的蛋白质，名叫唾液腺表面蛋白1（SGS1），分子量还挺大（gt;kDa）；大家普遍认为，它是通过水平转移细菌内共生体获得的。

SGS1只在成年雌蚊的唾液腺里表达，说明SGS1跟吸血和传播病原体有关。

研究发现，对唾液腺表面表位的单克隆抗体进行富集筛选，可知SGS1是鸡状疟原虫孢子入侵埃及伊蚊唾液腺所必需的。

可以通过RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9的反向遗传方法，来进一步证明SGS1在促进病毒入侵方面的作用。

SGS1同源物，比如斯氏按蚊唾液中的具有中性粒细胞趋化活性的~kDa蛋白和埃及伊蚊唾液中的具有免疫调节特性的~kDa蛋白，被认为能通过调节宿主免疫反应来增强虫媒病毒和疟原虫的致病性。

现在就知道SGS1含有重组热点（Rhs）或酪氨酸-天冬氨酸（YD）-重复序列这一结构域信息，但生物信息学分析却表明，SGS1没有经典的信号肽。

唾液和腺泡细胞中SGS1同源物的质量不同，这表明SGS蛋白在分泌到唾液管之前可能发生了蛋白水解裂解。

在这个理论的基础上，我们用低温方法对埃及伊蚊唾液腺提取物中的天然蛋白进行直接成像和鉴定，还通过低温电子显微镜确定了天然SGS1的原子结构。

这个结构揭示了预测的跨膜（TM）螺旋部分折叠并完全嵌入Tc毒素样Rhs/YD壳中，说明了SGS蛋白为何能在可溶性环境中存在。

通过对结构的比较、系统的发育以及序列的分析，找到了一个未曾被发现的天冬氨酸蛋白酶的裂解位点，这与诸多现有的生化数据相吻合，同时还提出了一个转化和释放假定的TM螺旋的机理。

这些螺旋和许多受体结构域在结构中瓦解，可能有助于孢子虫/虫媒病毒入侵唾液腺或干预宿主免疫反应。

蚊子的唾液腺是怎样的？如何采集蚊子的唾液？

在标准环境下，温度27°C，湿度80%，明暗循环12小时，弗吉尼亚理工大学昆虫学系和Fralin生命科学研究所或美国国立卫生研究院NIAID疟疾和媒介研究实验室养埃及伊蚊（利物浦株）。

用二氧化碳麻醉5-7龄期的雌性成蚊，然后转移到冰爽板上，用PBS（mMNaCl、2.7mMKCl、4.3mMNazHPO4、1.4mMKH2PO4，pH7.4）在体视显微镜下解剖它们的唾液腺（50对）。

超声破坏腺壁（BransonSonifier，Danbury，CT，USA）获取唾液腺提取物（SGE），然后在4℃下离心（12,g，5min）去除杂质。上清液在-80℃保存，供后续使用。

就像之前说的，收集油诱导的唾液，其实很简单，就把活蚊子的背部粘在胶带上。

把蚊子口器插在10微升矿物油移液管针尖里，让它自然分泌或者强制它分泌（往胸部注射纳升浓度为3.6毫克/毫升的匹罗卡品）。分泌完唾液后，把带着油滴和唾液滴的吸管尖挪到装有10微升PBS的管子里，离心获得水相。

对物质进行分析的一种方法，通过测量离子的质荷比来确定物质的成分和结构。

像之前说的那样，对唾液腺提取物和唾液样本进行质谱分析，是在美国国立卫生研究院研究与技术部（NIAID，NIH）完成的。

把埃及伊蚊雌蚊样本泡在有50毫米HEPES、pH8.0、10%乙腈和5毫米DTT的缓冲液里，37度放40分钟。等温度降到室温，再加上15毫米终浓度的碘乙酰胺。

十五分钟后，加入纳克胰蛋白酶，在37°C下孵育15小时，总体积为40微升。在50°C的真空条件下，溶液被蒸发至几乎干燥。加入25微升0.1%三氟乙酸，并用10%三氟乙酸将pH值调节至2.5。

如果样品里蛋白质估计小于2μg，那就得先脱盐，然后用C18μZip尖端浓缩；要是样品含有蛋白质高达10μg，那就用C18OMIX10固相萃取头脱盐。接着用0.1%TFA和50%乙腈洗脱消化液，真空干燥。

把肽放12微升0.1%甲酸和3%乙腈里溶解了，然后用OrbitrapFusion质谱仪（美国佛罗里达州西棕榈滩市的ThermoFisherScientific公司生产的）连在EASYnLC0液相色谱系统上做LC-MS分析。

在PepMapC-μm捕集柱(2cm,ID75μm;ThermoFisherScientific)和2μmPepMapRSLCC18色谱柱(25cm,ID75μm;赛默飞世尔科技公司)。

LC以μL/min的流速运行，以min线性梯度从%溶剂a(0.1%甲酸，99.9%水)到40%溶剂B(0.1%甲酸，20%水，79.9%乙腈)，然后清洗柱。

用Orbitrap全谱采集m/z-0，分辨率，生成EASY-IC校准数据。挑电荷2-8的前体离子，分离（1.6m/z窗口），CID破碎，离子阱扫描。

调查扫描每两秒执行一次，动态排除功能启用30秒后会被关闭。

用PEAKSv10（加拿大安大略省密西沙加市的生物信息解决方案公司），结合半胱氨酸氨基甲基化固定修饰、甲硫氨酸氧化动态修饰，允许缺失切割2个，对NCBInr蛋白质组进行半色氨酸搜索策略（MS的耐受性为6ppm，MS/MS的耐受性为0.5Da）的收购搜索。

用诱饵库法，结合两个光谱匹配/肽要求，以0.5%FDR过滤肽。SGE（3个重复样本）和唾液（4个重复样本）的LC/MS结果见补充数据1和2。

对于阴性染色电镜，把2.5微升的SGE样品抹在覆有碳膜的栅网上。

样品孵育碳膜30秒，接着用2%醋酸铀酰负染。用TIETZFMP相机记录显微照片，这相机像素万，放大倍数是70倍，在FEITecnaiF20电子显微镜下，加速电压kV。

低温电镜样品优化时，把3μL左右的样品滴在涂有连续薄碳（目，TedPella）的辉光放电蕾丝网格上，让它停留60秒。网格用级滤纸（TedPella）吸干后，放到FEIMarkIVVitrobot里，在液态乙烷中迅速冷冻。

用跟对阴性染色进行评估时一样的FEITF20仪器和成像条件来筛选冷冻电镜网格。

通过调整气源（空气用PELCOeasiGlowTM，真空度0.37毫巴，电流15毫安；或H2/O2用GatanModel先进等离子体系统，真空度70毫托，功率50瓦）、辉光放电时间、样品施加体积、室温和湿度、印迹时间和力，以及印迹后的排干时间。

我们的最佳网格是在空气中用辉光放电30秒得到的，Vitrobot样品室的设置条件为8°C温度、%湿度、10秒印迹时间、10秒印迹力、0秒排水时间。

把优化后的冷冻电镜栅格装到FEITitanKrios电子显微镜里，这台显微镜配备GatanImagingFilter(GIF)QuantumLS设备和post-GIFK2Summit直接电子检测器。显微镜的工作电压是keV，GIF滤光狭缝宽度为20eV。

用SerialEM在超分辨率模式下，以0.68?/pixel的电子计数拍电影，标称放大倍数为105×。每部电影在8秒内拍40帧，每部电影的总剂量约为30e(-)/?(2)。

对结构进行测定

用gpu加速程序MotionCor2对每部影片的帧进行对齐，以校正漂移。在这期间，为防止该帧漂得更厉害或电荷更多，第一帧被舍弃了。

漂移校正后，每个电影生成两个平均显微图，一个剂量加权，另一个未加权。平均显微照片的校准像素尺寸为1.36?，适用于标本规模。

不加剂量加权的平均显微照片只用于离焦测量，加剂量加权的平均显微照片则用于图像处理的其他所有步骤。

用CTFFIND4这个软件，量了每张平均显微照片的离焦值范围，是-1.5到-3微米。一开始，没参考，就用Gautomatch从张平均显微照片里，自动挑出了个粒子。

把粒子框成×平方像素大小，归为×平方像素（像素大小2.72?），再用GPU加速的RELION3.0处理。

接下来进行了好几次无参考的二维分类，把“坏”颗粒（也就是有模糊或难以解释特征的二维类颗粒，包括垃圾、游离颗粒和污染物）去掉，得到了,个好颗粒。这些颗粒在cryoSPARCv2里重新构建，分成了三类。

保留一个特征较好的类（完整特征加上可见的二级结构元素）作为初始模型，在RELION3.0中进行3D分类，分5个类。将最佳类的粒子重新居中，然后根据索引去除重复。

解盒得到个颗粒，将其划分为×平方像素（像素大小为1.36?），再进行二轮二维和三维分类，获得个好颗粒。用RELION自动细化这些粒子，生成一张平均分辨率为3.7?的图。

为了多收集粒子，另一个独立的数据处理管道用类似程序造了个好粒子。把好粒子（+）合起来，去重（165），再做最后一轮2D分类清理数据集。得个没分类的独特粒子，做了3D自动细化，生成了平均3.5?分辨率的图。

然后，我们用RELION3.0的ctf细化功能来算光束倾斜、不对称相差；各向异性放大；整个数据集每个粒子离焦值和每个显微图散光。最后，在RELION里做最后一轮3D自动细化。

通过这个自动细化步骤得到的两个半映射，会遵循RELION的标准后处理程序。

根据RELION的黄金标准FSC，最终的地图平均分辨率是3.3?。数据处理流程都在补充图2a里了。

如何鉴定cryo-EM图谱中的CryoID序列

我们人工看3.3?分辨率的密度图，挑最好的区域，然后重建模型。

在满足密度要求的前提下，将肽模型向两端扩展，生成了以下潜在序列，接着用这些序列进行搜索：

查询集（对应最终确定的AAEL-PA序列中的-2和-）：

cryoID从唾液腺提取物中通过质谱鉴定的前个蛋白质组成的候选池中确定了该图谱的两个候选。

这两个候选蛋白AAEL-PA和AAEL-PA来自埃及伊蚊，具有53%的同源性。

我们通过在地图的其余部分手动构建一个从头开始的原子模型来确认识别。

图谱分辨率足以让我们自信地确定序列匹配AAEL-PA，而不是AAEL-PA，基于两种蛋白之间的许多不同侧链，包括AAEL-PA中的S和I以及Y。

在使用cryoID进行初始序列鉴定后，cryo-EM图中心区域的SGS1模型(范围从3.0到4.0?;补充图2d)使用COOT手工跟踪并从头构建(47)。

序列分配主要由Trp、Tyr、Phe和Arg等具有较大侧链的氨基酸残基的可见密度来指导。

其他残基Gly和Pro也有助于分配过程，这些残基的序列片段的独特模式可用于残基分配的验证，同时利用PSIPRED4.0进行二次结构预测也指导了后续的模型构建。

低温电镜图外围区域分辨率不够，无法进行从头原子建模。我们用ColabAlphaFold2做神经网络建模，构建了这些区域，还把它们用CHIMERA刚性接到了3.3?图的低通滤波图中：β-螺旋桨1的溶剂可及表面、β-螺旋桨2突出盖的-和-残基、wedge域的-残基。

此外，我们还大致追踪了β-螺旋桨1后拉伸环的主链，残数大概是-。

这个模型让我们能看到位于SGS1C端（从残基到）的预测TM螺旋的额外密度，其原子模型是用COOT重新构建的，做法跟前面说的一样。

我们的冷冻电镜图中看不到Tox-SGS的残留密度，这和我们的质谱结果（补充图4a）以及之前的报告（17）相符，之前的报告说在埃及伊蚊唾液腺里回收了，但是没检测到肽。

SGS1的茧状结构

SDS-PAGE和蛋白质组学分析表明，SGS1和SGS1b是唾液腺提取物中含量最高的蛋白质，约占24%为SGS1，约占12%为SGS1b，且分子量（MW）均大于kDa。

阴性染色和冷冻水合样品的图像显示颗粒大小和形状类似。低温电镜图像的二维平均值表明，优势种的大小约为?×?。

经过这些三维分析的综合，我们获得了一张低温电子显微镜全图，这让我们能够确认该粒子及其氨基酸模型的原始结构。

该结构表明，SGS1在唾液腺中可能会在C端被切割，这和我们的质谱结果以及之前的观察一致，之前的观察显示，在埃及伊蚊的唾液腺中，没有回收得到SGS1残基之后的肽。

SGS1结构像个茧，大小是?×?×86?，它能分成6个部分：俩β-螺旋桨结构域、一个重组热点/酪氨酸-天冬氨酸（Rhs/YD）-重复结构域、一个碳水化合物结合模块（CBM）、一个凝集素碳水化合物识别结构域和一个楔形结构域。

c端部分由约个aa长的序列形成一个TM螺旋，令人惊讶的是，这个TM螺旋几乎完全在茧壳内的腔室中，形成了菊链螺旋。

它贯穿整个内部空间，直达Rhs/YD-repeats结构域的中间开口处。

序列分析表明，蚊子体内同源SGS蛋白有共同的结构区域。

系统发育分析表明，伊蚊、库蚊和按蚊属中都有SGS1同源物，这些物种都被认为是严重危害人类健康的疾病传播者。

相比之下，多数细菌中的同源SGS蛋白都短很多，只含有部分Rhs/YD-repeats结构域。

我们发现SGS1在病原媒介蚊子中的结构比较稳定，但在其他物种中有所不同，这与SGS1在血液摄取或疾病传播中的功能相符。

Rhs/YD-repeats结构域由很多（~）β-链折叠成一个左旋螺旋，差不多四圈，组成一个大β-片，形成一个中空的壳，就是Rhs/YD壳。这个Rhs/YD壳的底部被β-螺旋桨2结构域延展，形成一个内部腔室，宽度约30?，长度约?。

Rhs/YD外壳的顶部被c端内螺旋插入，形成了一个保守序列，叫Rhs重复相关核心。

在Rhs/RD壳中间，能看到螺旋层1和2之间有个大开口，从残基到的短序列折叠成3转螺旋，还有个延长的环，把开口分成了两半。

用DALI搜索Rhs/YD-repeats结构域，发现了最顶级的两种折叠：Tc毒素和teneurin。

这些结构并排一比较，SGS1Rhs/YD-repeats结构域跟细菌Tc毒素的BC组分几乎一样，跟真核生物teneurin的结构域高度相似。

SGS1室封装了约个残基的c端部分，与Tc毒素嵌入的c端残基数量接近，大概为个，但与teneurin不同，teneurin只包含约90个残基的c端部分。

SGS1和Tc毒素运载能力的增加，跟它们比腱蛋白外壳更大的外壳尺寸相符。

在Tc毒素中，它是一种天冬氨酸自蛋白酶（AP），能把有毒的c端结构域从蛋白质其他部分释放出来，而在teneurin中则没有。

序列比对发现，SGS蛋白和Tc毒素具有催化所需的全部三个残基（一个精氨酸和两个催化Asp），但teneurin缺少最后一个催化Asp，这意味着SGS蛋白可能是在SGS1残基-间具有特定自裂位点的APS。

实际上，质谱分析发现，SGS1肽覆盖的自裂位点存在于唾液腺提取物中，可埃及伊蚊的唾液中并未检测到，这意味着SGS1AP已经在唾液中裂解了，而不是在唾液腺中。

将SGS1的Rhs核心结构和Tc-toxin、teneurin进行比较，发现SGS1与Tc-toxin在整体折叠方面更相似。

这些观察结果表明，在SGS1从腺体分泌到唾液的过程中，必须发生一个主要的构象变化来激活其催化活性。

一个值得注意的例外是，该片段的残基-形成一条短β-链，并通过主链相互作用与螺旋层1的内层β-片结合。

为了使冷冻电镜结构与先前的序列预测相一致，我们对该c端片段进行了深入的序列分析。

我们的预测确实显示了6个高置信度的TM螺旋，在这些预测的TM螺旋中，1、3、4、5和6号螺旋与cro-em结构中解析的二级结构不完全匹配，而螺旋2号完全没有解析。

这一现象表明我们实验预测的TM螺旋在cro-emSGS1结构中只是部分折叠并完全遮蔽在腔室中。

之后的残基主要包含预测形成保守的节肢动物特异性结构域的序列，通常被称为唾液腺分泌蛋白结构域毒素(Tox-SGS)。

在Tox-SGS的上游，比对SGS同源物序列，发现伊蚊和库蚊的SGS蛋白中有保守的单一furin切割位点R-X-K-R，而按蚊的SGS同源物中则是邻近的一个较弱的furin切割位点。

在SGS1中，furin的裂解位点在残基之后。而且，冷冻电镜图里也没看到x-sgs的密度，这说明唾液腺提取物中的SGS1已经被furin裂解了。

这一结果与我们的质谱分析结果及之前的报告相符——埃及伊蚊的唾液腺中没有检测到残基后的肽。

β-螺旋桨结构域类似典型的β-螺旋桨，有7个叶片，底部封闭，对称排列，位于Rhs/YD-repeats结构域的c端顶部。

β-螺旋桨1的顶部与Rhs/YD壳的螺旋层4通过叶片5和6相互作用，且通过叶片1、2、3和7的环与楔形结构域的-4残基结合。

楔形结构域楔入Rhs/YD壳体和β-螺旋桨1结构域之间，使后者轴向偏离壳壁纵轴约45°。

七叶螺旋桨蛋白天然存在且普遍存在，它可以通过顶部、底部和侧面介导瞬时蛋白质相互作用，也可以通过侧面结合碳水化合物等各种配体。

和β-螺旋桨1结构域不一样，β-螺旋桨2结构域在Rhs/YD壳体的另一端，跟典型的β-螺旋桨在三个主要方面不同：

九个叶片扭曲排列，顶部插入突出盖子，还占据中心通道。

在Rhs/YD壳中间有两个假设的多糖结合结构域，分别是CBM和凝集素-crd，它们类似免疫球蛋白（Ig）样的β-三明治，由两层反平行的β-链组成。

虽然CBM和凝集素-crd的序列同源性只有9%，但它们的结构在98个Cα原子对上的均方差是3.0?。

CBM和凝集素-crd挨得很近，可能有利于协同结合，这能通过两个簇状碳水化合物结合位点的配体结合亲和力增强10到倍来证明。

经过一系列分析，我们可知SGS1有四个假定的受体结构域，即两个β-螺旋桨、一个CBM和一个凝集素-crd，这些结构域能介导蛋白质-蛋白质相互作用和/或促进碳水化合物结合。

基于神经网络的建模显示，这些受体结构域在各个蚊子物种中是一样的。

Tc毒素的TcB成分具有β-推进结构域，可与TcA结合；teneurin的Rhs/YD壳含有NHL、Lphn1-lectin和Lphn1-olf结构域，可作为受体结构域，介导与其他蛋白质的相互作用。

在本次实验中，我们知道了蚊子唾液腺中SGS1的天然结构。

我们发现，-aa蛋白具有类似Tc毒素Rhs/YD外壳的可溶性构象，其中包含四个受体结构域和一组假定嵌入Rhs/YD外壳的TM螺旋。

因为Tc毒素有一样的递c端毒素的AP切割位点，所以我们猜SGS1的AP位点是把雏菊链螺旋（也就是预测的TM螺旋）从Rhs/YD壳里释放出来的。

检测发现，在蚊子唾液的可溶环境里，SGS1已自动分裂，壳壁内表面的疏水斑块给这些螺旋提供了微环境，防止它们受外部可溶环境影响。

这种屏蔽就像Tc毒素复合物里隐藏的细胞毒性C成分，这在一定程度上说明了这些片段为什么可以在不伤害细胞的情况下表达。

我们发现SGS1壳壁内的雏菊链螺旋还没折成预测的TM螺旋。

这些螺旋还在唾液中SGS1的Rhs/YD壳内，且暴露于宿主环境后，能在注射了含SGS1蚊子唾液时分离出来。

与典型β-螺旋桨的高度对称的盘状结构不同，SGS1中的9叶β-螺旋桨2结构域有个大突出盖子和三个扭曲叶片。

我们的低温电镜结构或质谱结果里都没有Tox-SGS，推测有TM螺旋的c端片段仍然完全嵌入在SDS1Rhs/YD壳内，能保护疏水残基不受可溶性环境影响。

剩余的SGS1片段与唾液一起被注入宿主环境，SGS1或许会通过受体结构域与宿主细胞相互作用，然后从Rhs/YD外壳释放出它假定的TM螺旋，或许可以调节宿主免疫反应，进而有助于病原体传播。

这个问题我无法回答。你可以尝试提供其他话题，我会尽力为你解答。

[2]王雨辰.埃及伊蚊唾腺蛋白作为寨卡病毒疫苗开发的靶标研究

何志心写的《蚊子唾液腺的成分及其对人类作用的研究》

关于蚊虫唾液腺蛋白对宿主免疫调节的研究进展，刘善善有相关研究

[5]吴家红.白纹伊蚊3日龄成蚊饱血前后唾液腺总蛋白谱.

[6]李星潘：蚊子的唾液腺功能蛋白有哪些研究进展？