国内外血液制品技术对比

有专家指出,我国人血白蛋白和肌注丙球等主导血液制品工艺和质量与国外同类产品差距在10年左右。这种差距主要体现在血浆综合利用度、血浆分离工艺、处理制品安全性问题等三个方面。

判断血液制品企业技术水平的重要指标是分离出的血液制品的种类和数量。国内血液制品生产企业众多,其生产水平参差不齐,血浆综合利用度偏低,经济收益率远低于发达国家。国外每百吨血浆可创造9亿元左右的利润,而国内企业每百吨血浆仅创造1.5亿元的利润。

国内血液制品企业的产品品种单一,产品结构不合理,与国际差距较大。我国仅有5家企业拥有7种以上产品，其中最多的华兰生物和上海莱士也仅有11种产品，而国外企业通常都有20-24种产品。

（部分血液制品企业销售规模、毛利率和上市产数比较）

国内外血液制品的品种及质量往往取决于血浆分离技术的先进性。国外血液制品血浆蛋白的分离主要采用低温乙醇法并部分结合柱层析纯化的方法。

我国目前采用的低温乙醇法是利用蛋白质的亲水性和疏水性即溶解度不同进行分离，根据各种血浆蛋白理化性质的差别，加入不同浓度的乙醇，通过改变影响蛋白质稳定性的条件，而分别沉淀提取。大规模分离人血浆蛋白的低温乙醇方法是在上世纪40年代中期由Chon开发并建立的。通过大量的批处理步骤例如沉降和离心(或板框压滤)分离,所需蛋白质被逐级分离出来。影响蛋白质沉淀分离的主要因素有溶液的离子强度、蛋白质浓度、乙醇浓度、PH值和温度等。经过60多年的发展，血液制品的种类、质量、安全性及产量都有了大幅度的提高，其提取工艺也呈现了手段的多样性。目前部分厂家采用改良的低温乙醇Cohn6/9法或N-K法,部分厂家已采用压缩过滤法取代离心分离法用于生产，也有个别厂家采用分子筛层析工艺。对某些特定组分,还结合采用其它的提纯方法。另外还有一种仿生亲和层析工艺,它针对生物大分子结构的特点，研制出稳定、专一、高效的亲和层析载体,可以用于血浆蛋白的大规模分离提取，只需一步分离,即可获得高纯度、高收率的制品。因其工艺简便成本低廉,前景十分可观。

我国的低温乙醇法经历过采用离心机分离的离心工艺和采用板框式压滤分离的压滤工艺。国内现有的低温乙醇离心分离工艺在对蛋白悬浮液分离过程中,部分厂家采用低温连续离心法,该法存在白蛋白收率低(自血浆中可分离白蛋白约20~22g/L),制品外观质量欠佳等缺点。在离心操作中,要避免蛋白溶液在泵送和离心过程中,因高剪切力对沉淀颗粒造成的破坏,反应条件终止后,常将反应液静置一段时间,进行批次老化，促进沉淀形成,以改善离心分离质量。Titehener-Hooker等的研究表明,为使获得的沉淀蛋白颗粒强度增加、直径增大，对剪切力有强抵抗能力,在沉淀形成过程中的低频条件至关重要,如湍流推动、低频震荡、静态混合等。低频条件环境中形成的蛋白沉淀颗粒与搅拌状态下形成的不同,沉淀聚合时的结构会发生改变,这与其所处的低频条件下的流体加速度和流体力学应力相关。这更有利于离心分离,一方面在沉淀物的收集过程中,确保了固液相分离的质量,另一方面,可避免剪切力对蛋白表面结构的损伤,保持了蛋白的稳定性。

传统的低温乙醇沉淀分离法直接分离纯化的蛋白种类少,血浆利用率低。随着对新血液制品(如凝血因子和蛋白酶抑制剂)需求的增加,对产品纯度、安全性、产量、生产成本等要求的提高,越来越多的层析技术应用于血浆分离。目前,国外最为普遍的是采用低温乙醇法结合柱层析纯化的方法,甚至在生产的全过程采用层析法,而我国没有一家厂商在生产的全过程采用层析法。

低温乙醇法结合柱层析纯化的方法:先利用低温乙醇工艺得到的不同组分,再将之与不同类型的层析方法相结合生产血浆蛋白,或在低温乙醇工艺前,通过吸附层析等技术吸附微量蛋白,再进行其他血浆蛋白的分离纯化。上世纪70年代起,Curling和Berglof等开始运用层析技术大规模纯化血浆蛋白,至今已形成一定产业化规模。GrandGeorge等以F上清或FV沉淀作为起始原料,通过2次离子交换凝胶吸附及后续超滤配制得到CAE纯度%,无多聚体的白蛋白。ZLB公司也以FV沉淀为原料,用层析法生产白蛋白,将FV沉淀溶解后透析,经1次阴离子凝胶吸附,超滤调整参数、巴氏灭活、灌装、再巴氏灭活,得到合格产品。其产品中的触珠蛋白、q1酸性糖蛋白比例,内毒素和铝离子含量远低于低温乙醇工艺生产的白蛋白,白蛋白单体比例为95%左右,而一般低温乙醇工艺的白蛋白单体仅为90%左右。CLS公司实现了低温乙醇工艺结合层析工艺的产业化生产,完全实行自动化控制,成为全球最大的层析法生产的白蛋白的基地,其产品纯度可达到99.5%。其基本工艺流程是:低温乙醇工艺生产的FII+III上清,经超滤透析、脱醇脱盐后,依次经阴离子DEAESepharoseFF、阳离子CMSepharoseFF和分子筛SephaerylS-HR凝胶吸附,最终得到白蛋白产品。国内也对层析工艺进行了一定的研究,上海莱士、华兰生物和绿十字是国内仅有的3家生产凝血酶和凝血酶VIII因子的企业,使用分子筛SephaerylS-HR凝胶吸附层析粗提凝血酶和凝血酶VIII因子,再用低温乙醇法提取其他血浆蛋白。

目前国内越来越多的企业将层析技术运用到人血白蛋白、球蛋白等主要产品的纯化中,以提高产品的质量,如成都蓉生等企业经过低温乙醇分离过滤后,再采用离子交换层析分离纯化丙球蛋白,华兰生物采用血浆分离采用改良孔氏法,采用先进的离子交换层析、超滤纯化等工艺,但国内大部分企业还是缺乏与层析技术提取血浆蛋白相适应的能力。

国内外产品品种及质量往往取决于生产工艺的先进性,而安全性则取决于对原料血浆的严格筛检和对半成品或成品的病毒灭活方法。自80年代艾滋病的发现及凝血因子制剂使用发生HIV传播,采用低温乙醇法制备的血液制品的安全性引起重视。

低温乙醇工艺具有极大的优势,如乙醇和低温的抑菌作用,有助于得到无热原的产品;低温乙醇工艺多步分级沉淀和压滤分离均有助于去除或抑制HIV、HAV、HTLV-III等病毒,保证制品的安全性。

同时,超滤技术也大大的提高了制品的安全性。超滤具备了纯化和浓缩双重作用,在血浆蛋白分离上被广泛应用于脱盐、脱醇、浓缩,分离提纯,去热源等方面。血浆蛋白分离采用超滤技术能使得生产工艺设计和设备简单化,缩短了生产周期,减少污染,大大降低生产成本,提高了效益。国外从年起已将病毒灭活方法用于临床使用血液制品,且目前多为两种不同灭活机理的病毒灭活过程联合使用,而我国血液制品企业上世纪90年代后期才在血液制品生产中加入病毒灭活工艺。生产中仍只采用一种病毒灭活方法,很少联合采用两种病毒灭活工艺。除此之外,一些新的化学灭活因子研究也取得进展,例如维生素B2很可能利用其光化学特性,成为更有效、更广泛的灭活试剂。

保证血液制品安全性是一项复杂、艰巨的任务,要使血液制品的供应逐步接近零点危险度(Zerorisk),结合全球许多国家积累的经验,血液制品安全性必须依靠行政管理与专业技术相结合的综合性保证系统。