蓝耳病研究中和抗体在PRRSV保护免

O.J.Lopez,F.A.Osorio（美国）

摘要猪免疫系统中能够有效抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的保护免疫成分现在还知之甚少。虽然之前认为在PRRSV特异性免疫反应中抗体是有害而且无效的，但是现在认为中和抗体（NA）与抗PRRSV保护免疫具有重要联系。本文综述了目前有关动脉炎病毒特异性中和抗体方面的知识，中和抗体在抗PRRSV感染中的作用，以及能够诱导猪产生这种抗体的分子病毒结构。这些信息将对PRRSV新一代疫苗的设计有重要作用。图1展示了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染免疫活性猪过程中的一系列事件。多数情况下，PRRSV感染的早期特征是出现临床症状以及病毒在靶细胞中的大量增殖：肺泡和其他组织的巨噬细胞。急性感染早期后是组织中出现高水平的病毒载量和血清出现病毒血症，这些现象可能持续长达1个月。

图1.猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）后的一系列事件

在PRRSV感染急性期之后，是感染的持续阶段。在感染晚期，PRRSV在身体的某些部位，主要是在淋巴组织，以低载量水平持续存在。PRRSV的持续存在是一种持续的低水平病毒增殖，而不是真正意义上的稳定的持续性感染。病毒最终从身体中被清除掉，大多数动物在数月的急性感染后看起来都是这样的。估计至少需要天或更多时间才能%清除动物的感染。至于向其他同居动物排毒的情况，大多数实验室用幼猪来感染，结果在感染后2个月左右，排毒都能有效传染其他动物。然而，Bierk等人（）进行的田间试验表明，年长猪（母猪）的排毒能在感染45-86后传染给以前未感染过的同群猪。在感染的持续阶段，虽然囊膜糖蛋白和M蛋白基因有一些持续变异，但是持续感染PRRSV的基因组有几个高度遗传保守的区域。现在还不知道PRRSV持续感染的具体机制，根据逻辑推理，恢复期动物持续存在PRRSV的重要原因是宿主免疫系统未能产生抵抗该病毒的有效保护反应。猪抗PRRSV感染的有效保护免疫具体成分尚知之甚少。现在已经知道，某些减毒疫苗具有保护性，但是还没有研究保护的具体机制。另外，恢复期动物有特异性保护免疫。虽然该保护对其他PRRSV也有一定程度的异源保护，但是其看起来有毒株特异性偏好。猪感染4周后开始出现T细胞介导的反应。在感染后9天到感染后14周能检测到该反应。PRRSV感染猪还能建立针对该病毒的迟发超敏性反应，这说明有CD4辅助T细胞反应。基质蛋白M和糖蛋白GP5是CD4T细胞反应的靶标。T细胞产生的特异性γ干扰素，一种T细胞细胞毒性的衡量物，在反应中有延迟，这与观察到的中和抗体的产生相似。感染后PRRSV特异性抗体反应感染后早期，采用ELISA方法在感染后7-9天就能检测到PRRSV抗体反应（图1）。通过间接荧光抗体技术或免疫过氧化物酶单层细胞试验也能检测到血清转阳。然而，没有证据表明早期抗体反应能抗PRRSV感染。看起来感染早期的抗体不能在体外中和病毒，当用感染早期进行保护性试验时，这些感染早期抗体不能提供抵抗致病性PRRSV的被动保护。具有PRRSV中和活性的抗体在感染晚期才出现（一般是感染4周或4周后）。在早期无保护但大量产生的同源抗体出现的同时，发生了多克隆的B细胞激活，包括PRRSV感染后早期的自身抗体。PRRSV感染早期病毒血症阶段在血清中很快出现的PRRSV和PRRSV特异性抗体可以理解为抗体在抗PRRSV感染中是无效的。当血清中含有亚中和水平的抗体时可能在体内和体外增强PRRSV在巨噬细胞中的增殖，这个观点最终导致了这个普遍性结论：PRRSV抗体含有非保护性而且有害的反应。因为中和抗体出现晚而且不规律，所以中和抗体在PRRSV保护中可能的作用还不清楚。另外，中和抗体在抗PRRSV感染中作用的相关文献也是相互矛盾的。例如，一个研究报告说动物在感染PRRSV很长一段时间后，病毒在组织（扁桃体）中持续存在，而且血液中有高滴度的PRRSV中和抗体，这说明PRRSV中和抗体不能清除血液循环中的病毒。与这个假说相反，数个独立研究都认为中和抗体能够防止或阻断病毒血症。Yoon等人（）和Osorio等人（）报道说中和抗体能够预防病毒血症。同样的，一个最近的报道认为病毒血症的清除与主要中和抗体——GP5的出现具有明确的相关性。用GP5和M蛋白免疫能产生某种程度的保护，而且这种保护与中和抗体的出现是相关的。这与总体观察到的结论相一致，即大多数成功的病毒疫苗都是通过中和抗体产生保护的。要评估中和抗体介导的保护，一个标准的试验方法就是，用单克隆抗体或多克隆抗体进行被动免疫，然后再攻毒。这样的试验已经有效证明，对于许多感染不同种属的病毒以及通过不同途径感染的感染，体外的病毒中和活性和体内保护之间存在良好的相关性。某些情况下，中和抗体的出现，使得对某些病毒产生消除性免疫，如呼吸道合胞体病毒和猴/人获得性免疫缺陷病毒就是这样的例子。在其他情况下，中和抗体能对临床疾病产生完全的保护，即使在被动过继动物中还有一些病毒复制，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。另外，已有特异性针对人呼吸道合胞体病毒的商品化的“人源化”单克隆抗体，这抗体已经被成功用于高危感染的病人。在小鼠模型中，抗体与抗炎症抗体的成功联合使用，也打开了这样的可能性：在已经建立的感染中将中和抗体用作治疗性工具。其他动脉炎病毒已经证明了中和抗体在保护中的重要性。例如，针对马动脉炎病毒（EAV），动脉炎病毒属的代表，的保护主要是由中和抗体介导的。血清中和抗体的出现与血液循环中病毒的清除同时发生，相同的，对幼驹进行被动抗体过继转移降低了或预防了EAV感染。中和抗体主要针对GL蛋白（PRRSVGP5蛋白在EAV的同源蛋白）。GL蛋白胞外域有氨基酸左右。该蛋白的主要中和表位位于GL蛋白N端第二段疏水域的99-氨基酸。用含有原核表达GL18-氨基酸的重组蛋白疫苗进行免疫能诱导血清中的中和抗体。攻毒后，中和抗体水平和保护的程度具有相关性，这证明，中和抗体在抗EAV感染的保护中具有重要作用。鼠乳酸脱氢酶增高病毒（LDV）是另一个研究较好的动脉炎病毒，它能引起小鼠的无症状感染。小鼠过继转移中和抗体能保护其免受LDV-C感染。有数个研究指出，在抗PRRSV感染的保护中，中和抗体具有重要作用。在我们的试验中，PRRSV灭活的自家疫苗，不能诱导中和抗体，也没有保护性，相反，能诱导一定水平中和抗体的减毒疫苗具有保护性。试验感染后中和抗体的出现伴随着血液循环中和组织中病毒的清除。虽然，两者的机制，细胞免疫和中和抗体，可能参与了感染后的病毒清除，但是到目前为止，实验数据只显示了后者的重要性。另外，用编码PRRSVGP5的DNA疫苗免疫能诱导中等水平的中和抗体。尽管如此，这些猪受到同源性毒株攻毒后具有抵抗力。他们仅出现轻微发热，肺脏和纵膈淋巴结用MARC-传两代后才出现病毒。攻毒后2周，中和抗体效价升高到。因此，在我们的试验中发现，DNA疫苗免疫后的中和抗体反应诱导了能抵抗PRRSV减毒毒株的免疫反应。改良活疫苗免疫后，仅有低水平或不可检测的中和抗体反应，但是当用致病性PRRSV攻毒后中和抗体水平迅速升高。最近，我们实验室进行了血清过继试验，并明确证明仅PRRSV中和抗体就能完全预防PRRSV经胎盘感染并完全消除或预防怀孕母猪的感染。另外，中和抗体的过继转移提供了消除性免疫，因为用病毒分离，RT-PCR，或猪生物安全方法在母猪和子代中都不能检测到PRRSV。我们最近还观察到将中和抗体过继到仔猪看起来也能抵抗PRRSV感染。能够%保护受体仔猪在攻毒后不出现PRRSV病毒血症的最低中和抗体效价看起来是1:8。因此，血清中和抗体的效价与抗PRRSV保护免疫有关，母猪是肯定的，幼猪也有可能。这些数据支持这个可能性：PRRSV高危感染动物可以通过被动过继中和抗体免疫球蛋白，用中和抗体来提供暂时的保护。另外，中和抗体也可用于治疗，虽然还不知道中和抗体清除或缩短之前已建立感染的效果如何。我们期望用高浓度中和抗体免疫球蛋白来治疗或预防PRRSV感染。可以通过重组DNA技术来克隆中和抗体进而获得大量中和抗体，或者如最近报道的方法，可以用PRRSV免疫母鸡，然后从蛋黄直接纯化高浓度PRRSV特异性中和抗体。现已知道，主要中和抗体表位位于PRRSVGP5。除了GP5上的主要中和表位，用单克隆抗体在囊膜蛋白GP4上发现了至少1个中和表位，M蛋白也至少有1个。GP5在胞外域的氨基端有严重的糖基化，并与M蛋白形成异源二聚体。通过反向疫苗学和涉及重叠肽的研究，发现了能诱导PRRSV中和活性抗体的GP5主要中和表位。并发现了该主要中和表位最小抗原区域的核心是37-44氨基酸。该抗原性中和表位也被称为表位B。该中和表位B能被中和性单克隆抗体识别，同时还能被上述被动过继试验中使用的高保护力PRRSV抗体识别。另外，Wissink等人（）证明中和性单克隆抗体能识别欧洲型PRRSVN端胞外域表位。与此相反，Plagemann（）使用恢复期动物血清发现，欧洲型和美洲型都有中和表位，对两者的抗原图谱分析都与我们对表位B的描述相一致。所有这些结果表明GP5胞外域在PRRSV生物学中有重要作用。在PRRSVGP5胞外域的免疫显性区域还发现了一个被称为表位A的表位。感染后表位A能迅速诱导强烈的非中和抗体反应。表位A核心（27-31氨基酸）位于表位B氨基端前7个氨基酸。这些特征与诱饵表位功能相一致。诱饵表位也许会削弱临近中和表位的免疫反应性，HIVGP41蛋白就是这样的例子。位于HIV-1gp41的中和表位（ERDRD）在兔子中具有免疫原性。然而，当表位ERDRD并列位于一个免疫显性非中和抗体表位IEEE边上时（位于gp41原始序列2个氨基酸距离），该反应能被完全消除。因此，诱饵表位IEEE降低了中和表位ERDRD的中和抗体反应。用含有ERDRD基序而无IEEE表位的多肽免疫小鼠获得的血清中，具有中和能力的多克隆抗体浓度能达到0.1-0.2ug/ml。研究较好的乳酸脱氢酶增高病毒（LDV）中和抗体所针对的区域是VP-3P蛋白37-44氨基酸，其为LDVVP-3P的唯一中和表位。该病毒神经嗜性变异毒株VP-3P丧失了3个糖基化位点，这使得该病毒对体外中和更加敏感。另外，含有CP-3P区域的合成肽能被中和性单克隆抗体识别，这使得研发一种检测血清中和抗体的ELISA方法成为可能。然而，针对这些多肽的抗体不能中和LDV，这说明这些多肽的构象不合适或者这个核心区域外的某些其他残基是诱导中和抗体所必需的。组成PRRSVGP5表位B的肽段通过位于碳端的半胱氨酸偶联到KLH，或者组成人工多肽（MAP）用于免疫小鼠和猪。虽然这些免疫动物产生了针对这些多肽的抗体，但是这些抗体却并不能中和PRRSV（未发表数据）。因此，PRRSV中和表位具有与LDV相似的特征：（1）正如LDV中和表位一样，PRRSVLDV看起来具有抗原性，因为中和表位能被中和抗体识别，但是（2）不具有免疫原性，因为它不能诱导中和抗体，这表明其他附加的残基也许对诱导中和抗体是至关重要的。总之，在PRRSV模型观察到的这些现象，根据其他动脉炎病毒，或许证明了两点：（1）中和抗体在预防PRRSV感染中具有关键作用（正如EAV一样）；（2）中和抗体主要针对PRRSVGP5蛋白胞外域的一个主要表位（正如EAV的GL蛋白和LDV的VP-3P蛋白）。中和表位的突变，该过程被称为抗原漂变，是RNA病毒所使用的经典免疫逃逸机制。然而，在某些情况下中和表位位于具有重要致病性功能的糖蛋白区域（也就是说与细胞受体相互作用，一个增殖和入侵宿主的重要基本步骤）。在这种情况下，这个特殊表位的突变对该病毒不利，因此其他可能的机制就变得非常重要，正如PRRSV所展示，尤其是为了逃逸免疫监视和在宿主持续性感染。感染早期就产生针对诱饵表位A的抗体，而在感染后30天都不能检测到针对表位B的抗体。因此，表位A和出现在表位B周围的糖或许掩盖了针对中和表位的反应。抗表位B抗体（即中和抗体）产生的延迟也许是解释之前作者描述的缺乏PRRSV中和抗体的基础。因此，中和抗体产生的延迟或许是逃逸免疫监视（这也是PRRSV感染的特征之一）的主要机制。猪抗PRRSV保护免疫反应的模式根据以上描述的数位研究者的数据，我们阐释了PRRSV驱动的病毒特异性免疫反应调节模式。暴露于PRRSV后，发生了延迟的，急性感染，其特征是病毒血症能持续30天以上。当细胞免疫力（以PRRSV特异性和/或非特异性γ干扰素产生细胞为表现），以及中和抗体出现以后病毒被清除掉。这种抗PRRSV保护免疫在感染后4周才出现并在接下来数周增强。PRRSV看起来能建立其他机制来逃逸免疫监视。例如，感染后仅诱导低水平的α干扰素，降低危险信号水平，这些信号能诱导强烈的特异性细胞反应。至于抗体，多克隆的扩增分散了特异性抗体反应。另外，感染后最初数周针对GP5胞外域的抗体反应多数集中于免疫显性但非中和表位A的反应。其中一个可能性是表位A以及胞外域的糖掩盖了B淋巴细胞表面的特异性膜IgM识别表位B。通过不同的预测方法，一些研究人员假设GP5先导区的切割位点位于31-32氨基酸之间，而另一些则提出该位点位于25和26氨基酸之间。我们提出假说，在感染过程的后期有可能出现PRRSV各种突变体，其糖基化可能消失和/或GP5切割位点改变，并产生了一些在31和32位氨基酸之间切割的无表位A的GP5。含有这种分子形式GP5的PRRSV能诱导针对表位B的微弱但有保护性的免疫反应。例如，有报道说GP5蛋白44位氨基酸NàS的突变毒株具有神经嗜性，该病毒在GP5该部位无糖基化修饰。该突变与DLV的另一个NàS突变相似，这验证了该分离毒株的神经嗜性使得LDV对中和更加敏感。

图2.PRRSV疫苗的理想反应

保护性细胞免疫和体液免疫产生延迟，使得PRRSV在该免疫空白期内于宿主体内大量增殖，排毒并感染其他猪。在该过程的后期，中和抗体的出现（能消除病毒血症）以及细胞免疫反应（能消灭被感染的细胞）能最终将病毒从组织中清除。因此，在感染的持续阶段，当抗体能有效清除病毒时，对病毒来说表位B的突变将不会再具有进化优势。血清中和抗体的水平与表位B特异性B淋巴细胞克隆的增多相关。PRRSV的再次感染会激活这些克隆并将诱导更快、更强的中和抗体反应，这与免疫动物用致病性毒株攻毒后观察到的现象一致。因此，减毒疫苗和其他免疫原，如DNA疫苗能通过野生型PRRSV复制出相同的逃逸机制（图2A）。一个理想的PRRSV疫苗将能够在短时间内诱导针对该病毒的高水平的中和抗体和特异性细胞反应（图2B）。

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