没有转化体系的物种,如何研究其基因功能

　

伯小远经常碰见老师研究的物种没有成熟的遗传转化体系，这意味着过表达基因和敲除基因都做不了，连这种最基础的实验都做不了，那如何研究基因功能呢，是不是就真的没办法解决了呢，下面跟着伯小远来看看吧。

1常规基因功能研究套路总结

首先，我们先来回忆一下常规研究模式植物基因功能的方法，伯小远在之前的文章里写过不少，再做个总结吧（图1）。

在看图之前，大家一定要理解研究基因功能的两种遗传学方法——正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学是指，对细胞、组织或个体的基因组进行突变，然后鉴定被改变的性状，找到突变基因并揭示其功能。反向遗传学是指，利用已知的基因组序列信息，通过分子生物学手段干扰靶基因正常表达并寻找其相对应的表型性状。简单来说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

图1基因功能研究套路，图片来源：伯远生物。

A1-A3：EMS诱变、辐射诱变、自然突变或其他方式获得差异性状材料，一般不知道突变在哪里，需要极辛苦地去鉴定。

A4-A5：T-DNA插入突变体库、激活标签突变体库，不知道突变在哪里，但可以轻松鉴定。现在有些实验室已经创制了基因编辑突变体库，它相比标签突变体库的优点是，能够更直接的知道突变基因的位置和突变情况。

B1：由A1-A3获得基因的方法：图位克隆、混合分组分析（BSA）、全基因组关联分析（GWAS）。B2：因为标签序列是已知的，所以可以根据这些标签序列通过TAILPCR的方法找到插入位点，就可以很快的知道哪个基因被插入或激活。B3：通过转录组/蛋白组/代谢组差异表达分析获得的基因，通过蛋白-核酸相互作用实验、蛋白-蛋白相互作用实验，根据已研究过的基因的同源性找到的基因，这些基因是先知道序列但是不知道其对应的性状/功能，所以需要通过功能验证进行进一步的分析。

B：一般在获得候选基因的序列后，会在本物种中对同源基因进行序列比对，以及在不同物种中对该基因及其同源基因甚至蛋白序列进行序列比对、进化关系分析等。

C1：克隆模板：一般是cDNA，少数情况会选择以基因组为模板。

C2：克隆模板：基因组。

C3：克隆模板：基因组，这里的非编码序列是指miRNA、lncRNA、circRNA。

注：C中如果不知道完整的基因组序列可用DNAwalking技术，如果不知道完整的CDS序列，可试试3’RACE、5’RACE技术。

D1：构建载体：按载体功能分类，构建过表达载体/互补载体、发夹干扰载体、amiRNA载体、基因编辑载体等；按启动子功能分类，除了常用的组成型表达载体，也会根据实验目的构建诱导型启动子、组织特异性启动子载体。

D2：构建启动子分析载体：研究基因的时空表达，即目的基因的启动子+报告基因；启动子活性分析/启动子和转录因子是否相互作用：使用双荧光素酶报告基因系统检测。

D3：构建载体：过表达miRNA/lncRNA/circRNA前体、构建STTM载体以干扰miRNA。

注：D中所涉及的载体构建技术：传统的双酶切-连接-转化、Gateway克隆技术、GoldenGate克隆技术、Gibson同源重组技术，现在一般使用后两种构建技术。

E：植物转基因技术，一般使用农杆菌介导的遗传转化体系，优点是效率高、T-DNA整合效果好、拷贝数低。

F：对转基因植株的检测：

1、确定转基因阳性植株：PCR（由于实验室气溶胶污染易出现假阳性，建立标准PCR实验室可避免出现这种情况），也可以使用试纸条快速鉴定真核抗性基因；

2、荧光定量PCR（qRT-PCR），检测基因的相对表达量即mRNA的相对表达量的，用来分析基因表达丰度和性状之间的相关性；注意qRT-PCR还可以用于检测miRNA/lncRNA、拷贝数鉴定、绝对定量等；

3、Westernblot，用来分析蛋白表达量及其与性状之间的相关性；

4、TAILPCR技术分析转基因插入位点在基因组的位置；

5、Southernblot技术用于分析转基因拷贝数（也可以使用qRT-PCR进行确定，但Southern是金标准）。

G1：体外表达纯化，可以用大肠杆菌或酵母，然后通过蛋白标签进行亲和纯化。对于编码基因可以进行体外表达，纯化到目标蛋白后可以做一些体外活性实验，如果是一个酶可以做催化活性验证，如果是转录因子可以进一步分析其识别的DNA元件，如果是信号蛋白可以进一步分析其相互作用蛋白。

G2：亚细胞定位实验：先通过生物信息学预测基因的定位区域，然后通过与Marker蛋白共定位确定其亚细胞定位的位置。

G3：筛选蛋白-蛋白相互作用：酵母双杂筛库、IP-MS、Pulldown-MS等；

检测蛋白-蛋白相互作用：酵母双杂、Co-IP、GSTPull-down、BiFC、荧光素酶蛋白互作分析等。

G4：筛选蛋白-核酸相互作用：酵母单杂筛库（用启动子筛选转录因子）、CHIP-seq（用转录因子找启动子）、DNA/RNAPull-down、RIP等；

检测蛋白-核酸相互作用：酵母单杂、EMSA、CHIP、双荧光素酶报告基因系统、DNA/RNAPull-down、RIP等。

H：可将上述实验结果再结合转录组、蛋白组、代谢组等数据一起分析，这些结果原则上具有一致性和统一性，能够相互解释和印证。由蛋白实验筛选出的相互作用蛋白、核酸等可重复以上研究路线，通过表型或检测数据更进一步将信号通路范围拓宽，最终推断出信号通路图。

注：伯小远在这里只总结了较常见的实验思路，还有许多实验大家可以根据不同的实验目的再自行补充总结喔！

2研究套路之材料起始

2.1有转化体系

图位克隆，是正向遗传学中克隆目的基因的经典方法，首先建立目的基因的近等基因系、重组自交系等遗传分离群体，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，用与目的基因连锁的分子标记筛选基因组文库，构建覆盖目的基因区域的物理图谱，获得含有目的基因的大片段克隆，再通过转化互补法等方法最终确定目的基因，其工作量十分巨大。

近些年由于测序技术的发展，也可以采用混池分组分析法（BulkedSegregantAnalysis，BSA）、全基因组关联分析（Genome-wideassociationstudy，GWAS）等进行目的基因的鉴定。篇幅所限，大家如果感兴趣，请留言喔，伯小远可以视情况专门写一篇介绍喔！

通过反向遗传学手段获得的目的基因，大多数时候对其序列就非常明确了，在此就不多说啦。

2.2无转化体系

同上。无转化体系的物种依然可以构建遗传分离群体、克隆目的基因。

注：本文所指的无转化体系的物种主要是指已测序但没有成熟转化体系的物种喔。如果是无参考序列也没有成熟转化体系的物种，那最好还是先做个全基因组测序喔。

3研究套路之基因克隆

3.1有转化体系

有时候当我们只得到目的基因部分的基因组序列时，可以通过染色体步移（DNAwalking）技术来得到基因组完整序列。

图2染色体步移的实验原理。基于PCR技术的染色体步移技术先后有十几种方法，可以克隆已知序列的侧翼未知序列，目前最常使用的是TAILPCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，热不对称交错PCR）技术，利用特异性套嵌引物，结合简并引物钓取侧翼序列。其基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异引物（SP1，SP2，SP3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（AD）相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物。

如果只有目的基因部分的CDS序列时，想要得到基因完整的CDS序列，可以通过3’RACE、5’RACE技术来得到完整序列。

图33’RACE原理图。cDNA末端快速扩增技术（RapidamplificationofcDNAends，RACE）是一种根据部分cDNA序列基于RCR方法获取完整cDNA全长的技术。

图45’RACE原理图。

3.2无转化体系

同上。无转化体系的物种依然可以通过染色体步移得到目的基因在基因组上的完整序列，通过3’RACE、5’RACE技术来得到目的基因完整的CDS序列。

4研究套路之功能验证

对于有转化体系的物种，如前所述，功能验证的实验主要包括构建载体、遗传转化、检测实验、蛋白实验等，这部分大家都比较熟悉，那么伯小远就选择一些比较重要的实验来说明啦。

构建载体的方法在有转化体系的物种和无转化体系的物种是通用的，具体可参考文章“细数常用的几种载体构建系统”、“载体构建的"利器"--GoldenGate”、“一文解决80%的双元载体问题”。

4.1有转化体系

4.1.1基因的时空表达模式

在研究一个基因的功能前，首先要在mRNA和蛋白质两个水平上对基因的时空表达进行分析，即检测野生型、突变体在正常或胁迫条件下，该基因在不同部位是否表达以及表达水平的高低等，从而明确其表达规律。

对于基因时空表达模式的分析，主要有以下几种方法：

4.1.1.1在mRNA水平上通过荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行研究。

qRT-PCR技术的介绍可参考文章“qPCR技术，你需要知道这些事！”

图5在高磷和低磷条件下，使用qRT-PCR技术检测GmSPX基因在大豆不同部位的表达水平(Yaoetal.)。GmSPX是磷信号通路中的重要蛋白。本图表示通过qRT-PCR研究了在营养液或沙培养中生长的大豆的各种器官中GmSPX家族成员的表达情况。

4.1.1.2在mRNA水平上通过原位杂交进行研究。

原位杂交（FISH），是在放射性ISH基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA按照碱基互补配对原则进行配对，形成核酸杂交分子。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子（如生物素、地高辛），可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的化学反应，促使探针信号被荧光显微镜捕获，从而对待测DNA或RNA进行定性、定量或相对定位分析。

FISH常用于细胞、医学实验中对非编码RNA的研究，因为非编码RNA不会产生蛋白，做不了亚细胞定位等实验，只能做FISH来看定位了。而由于植物的许多天然分子会产生自发荧光，因此在植物里使用这种方法来进行研究的相对还不是很多噢。

图6FISH法检测拟南芥细胞中的PP2AmRNA和新转录出的PP2ARNA(Duncanetal.)。蛋白磷酸酶2A（PP2A）可作为qRT-PCR内参基因，因为其转录相对不受胁迫的干扰，在各组织各时期转录量比较均匀。图中是用PP2AmRNA（红色）和新转录出的PP2ARNA（绿色）标记的细胞代表性图像。蓝色是DAPI标记细胞核DNA。（a-c）分生组织细胞的代表性图像，显示细胞质PP2AmRNA和两个位于细胞核内的活跃转录位点；（d-f）是（a-c）白色虚线框的放大部分；（g-i）有丝分裂过程中细胞的代表性图像，显示PP2A基因没有转录，因为没有新转录出的PP2ARNA。

4.1.1.3在蛋白水平上通过Westernblot方法进行研究。

蛋白质免疫印迹实验（Westernblot）是将细胞或组织中的蛋白质通过电泳分离，从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某种抗原（目的蛋白）的一种检测实验。使用特异性抗体对样品进行着色，通过分析着色的位置和深浅获得目的蛋白在细胞或组织中表达情况的信息。

图7抗原和抗体结合的原理示意图。抗体以Y型单元的形式存在，由四条多肽链组成，每个Y含有两个相同的重链拷贝和两个相同的轻链拷贝。Y型单元由两个可变的抗原特异性Fab臂和与免疫细胞Fc受体结合的恒定Fc尾，Fab臂对实际的抗原结合至关重要。

大家在实验室中应该经常听到师兄师姐们提到一抗或者二抗，那它们又是什么呢？

一抗是一种免疫球蛋白，能特异性结合目的蛋白或重点研究的其他生物分子，目的是对其进行纯化、检测和测量。使用小鼠、大鼠、兔子、山羊和其他动物作为寄主，可将一抗培育成多克隆或单克隆抗体，并且可直接购买或定制。

二抗可结合针对某一特定物种（如兔子）的所有一抗，即抗体的抗体，属于通用型抗体。二抗上会耦联标记，例如酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物）、荧光基团（FITC、Rhodamine、TexasRed、PE、Rhodamine、Dylight）、生物素、金颗粒等，这些标记可以很容易被检测出来，这样就可以指示出目的蛋白。

如果一抗自带可以被检测出的耦联标记，则不需要二抗，但这样会导致生产成本很高，所以商业化的二抗就设计为可识别所有的一抗，这样可以免去对每一个一抗进行标记。

图8目的蛋白、一抗、二抗结合示意图。一抗用来特异性识别目的蛋白，二抗用来放大信号并显色。

图9Westernblot实验流程图。图片来源：Biochemlife。实验流程大致分为：提蛋白，蛋白含量测定，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白样品，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗，显影。

图10FIE蛋白的表达量随春化时间的延长而变化(Woodetal.)。拟南芥在16h光照/8h黑暗的正常条件下培养12d后转移至4℃培养，在培养的第0、1、8、16、32d取样检测FIE蛋白的表达情况（1-5泳道），在结束32d春化后移回正常培养条件2d后取样检测FIE蛋白的表达情况（第6泳道）。

4.1.1.4在蛋白水平上通过免疫组织化学染色进行研究。

免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）通过抗体识别靶标抗原完成。抗体具有高特异性，与组织切片中的目标抗原专一性结合，随后，可利用化学显色或荧光检测使抗原-抗体相互作用可视化。

在化学显色中，将酶偶联到抗体，酶会催化底物在抗原位置产生有色沉淀，这种称为显色免疫组织化学（Chromogenicimmunohistochemistry，CIH）；在荧光检测中，将荧光素偶联到抗体，然后利用荧光显微镜使其可视化，这种称为免疫荧光（Immunofluorescence，IF）。

免疫组织化学染色可以定性、定量检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、多糖、病原体等均可被检测。反过来，也可以利用此原理检测目标抗体的存在，但是其应用不多，在这里就不再展开讲啦。

4.1.1.4.1IHC中的显色免疫组织化学（CIH）

图11CIH原理图。细胞暴露于与特定抗原（黄色）结合的一抗（红色），一抗结合与酶（黄色）化学偶联的二抗（紫色），该酶可将底物的颜色改变（例如，白色变绿色）。

图12使用CIH方法分别在光学显微镜（a）和透射电子显微镜（b）下观察靶标蛋白(Khoshraveshetal.)。（a）对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶免疫定位后的银增强观察；（b）对水稻叶肉细胞中甘氨酸脱羧酶P亚基的免疫定位。

4.1.1.4.2IHC中的免疫荧光（IF）

图13IF原理图。直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上；间接法：先用特异抗体（一抗）与样本中的抗原进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体（二抗）与抗原反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物。上述的CIH其实也分为直接法和间接法，原理与此类似。

图14OsMGT3蛋白的表达模式和亚细胞定位情况(Lietal.)。该文研究了转运蛋白OsMGT对叶绿体中Mg2+的转运调控影响了水稻的光合效率。（a-e）OsMGT3蛋白表达的组织特异性。使用GFP的抗体对pOsMGT3-GFP转基因水稻（a-d）和野生型水稻（e）进行免疫染色，组织来自距根尖10mm的根横截面（a）、基部节点（b）、叶片（c、e）、叶鞘（d）。红色表示来自GFP抗体的信号，青色表示水稻的细胞壁。（f-h）水稻原生质体中OsMGT3的亚细胞定位。OsMGT3-GFP在水稻原生质体中瞬时表达，该定位信号显示与叶绿体自发荧光信号可重叠，说明OsMGT3定位于叶绿体中。（i、j）对OsMGT3-GFP转基因水稻的叶片进行免疫染色。绿色表示来自GFP抗体的信号，粉色表示叶绿体，青色表示水稻的细胞壁。

注：组织化学染色和免疫组织化学染色的原理是不一样的，大家要注意区分喔。组织化学染色，是指在得到植物组织切片后，通过各种染料去染切片，再在显微镜下观察，可以了解这些物质在细胞内的化学组成、定位、含量等，进而可以了解整个细胞及组织的形态、化学成分、功能和代谢变化。这种染料显色的原理主要是染料与细胞内的物质发生物理反应或化学反应，与免疫反应无关噢！

例如，使用番红固绿染色可以显示植物的木质部，碘-碘化钾可以显示植物细胞内的淀粉和蛋白质，NBT染色可显示活性氧，苯胺蓝染色显示胼胝质等。

图15枣椰树根的解剖结构(Bokoretal.)。（A）主根；（B、C）侧根；不定根的横切面（D-H）和纵切面（I、J）。使用阿利新蓝/番红（A、B、D、E、H-J）或碱性品红（F）染色的石蜡包埋切片，未染色的自发荧光（C）和在紫外光下用荧光黄染色的切片（G）。

4.1.1.5在蛋白水平上通过亚细胞定位进行研究。

一般情况下我们对基因的功能进行预测之后，会首先做一个亚细胞定位分析，因为这个能较快拿到实验结果。了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理是非常必要的。

目前比较常用的就是将目标基因与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬时转化技术使该融合蛋白在受体材料细胞内表达，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置确定目标蛋白的位置，从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。受体材料一般常用烟草叶片、原生质体、洋葱表皮细胞。更多干货可参考文章“再也不用担心目的基因定位在哪儿了”。

4.1.1.6在蛋白水平上通过检测报告基因的表达情况进行研究。

使用“目的基因的启动子-目的基因-报告基因-终止子”的载体构建方式，转化后进行可视化检测或化学发光检测（这里需要特别说明一下，很多时候加上目的基因后后面的报告基因表达不是特别强烈，因此，在文章中常常见到去掉目的基因，即“目的基因启动子-报告基因-终止子”的形式进行研究，但是，大家要清楚不加目的基因，单纯使用目的基因启动子加报告基因其实是转录水平的研究，并不是严格意义上蛋白水平的研究）。常见的报告基因有GUS（β-葡萄糖苷酸酶基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因），lacZ（β-半乳糖苷酶基因）、LUC（萤火虫荧光素酶基因）等。这里伯小远就不再多说了，更多研究启动子的方法可参考文章“启动子研究方法高质量总结”。

图16侧根形成过程中PIN的表达和定位模式(Benkovaetal.)。PIN蛋白家族是一种公认的生长素输出载体。分别将PIN1、PIN2、PIN3、PIN4、PIN6基因的启动子与GUS基因相连，得到稳定转化的植株后，再进行观察。

4.1.2创建突变体库或直接购买

创建突变体库的方法比较多，该部分的内容可参考文章“突变体库，如何创建”。

最出名的突变体库大概是拟南芥SALK突变体库，另外，SALK突变体的检测方法可见文章“快收好，拟南芥突变体鉴定方法！”

4.1.3转基因研究

有转化体系的物种在基因功能研究中必然会使用转基因技术，一般包括过表达基因、敲除基因、敲低基因及功能互补实验。

该部分的内容可参考文章“基因功能研究的那些套路你知道多少？（中）”。

4.1.4蛋白实验

如果上面的实验大部分都做过了，可以往蛋白方向做一些实验，这样可以形成网状的信号通路，可以大大的提高文章的影响力。

找一个基因的互作基因一般可以做酵母筛库或者IP-MS（寻找与目的蛋白相互作用的蛋白），如果这个基因是转录因子，想找与它作用的启动子的话，可以做CHIP-seq，如果研究这个基因的启动子作用于哪个转录因子，可以做酵母单杂筛库。找到互作蛋白之后还需要通过其它的方法确定它们的上下游关系，为了让结果更具可信度，一般需要通过遗传学的方法进行验证！

不管是研究蛋白-蛋白相互作用，还是蛋白-核酸相互作用，在筛选出可能的相互作用后，必须要进行点对点的验证，大家一定要记得，一般体外和体内的点对点验证方法分别要使用1-2种方法相互验证结果喔！

图17蛋白-蛋白相互作用的筛选和点对点验证方法总结。

图18蛋白-核酸相互作用的筛选和点对点验证方法总结。

小远叨叨

伯小远也没想到一不小心就写了这么多，本文主要总结了常规基因功能研究套路思路，并详细介绍了有转化体系物种的一些功能验证方法，受篇幅所限，“无转化体系的物种的功能验证方法”只能在第（二）期的4.2再和大家分享啦，伯小远准备从建立瞬时转化体系、VIGS技术、使用愈伤/悬浮细胞、嫁接、使用酵母突变体株、异源转化等方法来写无转化体系物种的功能验证方法，欢迎大家多多分享相关的文献给伯小远哈！限于自身的知识水平，伯小远有很多没考虑全面的地方还望大家不吝赐教喔！

References：

BenkovaE,MichniewiczM,SauerM,TeichmannT,SeifertovaD,JurgensG,FrimlJ()Local,efflux-dependentauxingradientsasa

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