论文集十一猪支原体病十二其他

　基于巴马猪的猪支原体肺炎发病模型的建立

甘源，谢星，张磊，熊祺琰，杨浩，刘蓓蓓，韦艳娜，王海燕，倪博，王佳，白昀，

张珍珍，陈蓉，郝飞，邵国青，冯志新*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言猪肺炎支原体（Mhyo）是引发猪地方性肺炎的主要病原，感染猪通常表现出不同生长阶段的咳嗽，哮喘和发育不良等症状，剖检病变主要为肺的尖叶、心叶及隔叶出现对称性的“虾肉样”实变，且易与其他猪呼吸道病原混合或继发感染，引发猪呼吸道病变综合征，对养猪业造成巨大的经济损失。体型较大的家猪作为Mhyo致病性和疫苗评估的实验动物被广泛应用，然而，其诸如重复性及操作便利性较差的缺点促使亟需寻找遗传稳定，体型小和易感性强的替代实验动物。巴马猪采用基础群内闭锁纯繁选育，或是以半同胞为主的近交方式进行选育，遗传性稳定，一致性好，且加之体形小、比起家猪具有采样操作简单等特点，但目前尚无巴马小型猪感染Mhyo模型的报道。材料与方法运用0日龄超早期断奶技术培育的巴马猪群进行猪肺支原体的感染试验，随机选取8头7周龄的初乳剥夺（SF-pCD）巴马小型猪。分为感染组（n=5，气管接种，剂量为5×CCU/mLMhyo强毒力菌株JS，5mL/头）和对照组（n=3，KM2培养基，5mL/头）。通过感染后的临床症状观察、运用血清学、病原学、肺脏病变评分及病理学等指标进行评价。结果与讨论所有感染组的猪接种后14天均出现临床症状。感染后28天剖检，感染组肺脏发病典型，且肺部病变评分均分达到15分，病理检查显示感染组肺脏出现明显的炎性细胞浸润与组织损伤。扫描电镜观察感染组猪支气管组织显示严重的纤毛细胞脱落损伤，粘液分泌显著增加。感染猪在感染后28天血清中特异性IgG抗体和呼吸道特异性sIgA抗体出现转阳。利用免疫组化法观察到了感染猪肺组织中显示较多的阳性棕褐色着色。通过定量PCR方法检测感染组每头猪的肺泡灌洗液（BALF）中Mhyo的DNA拷贝数均超过。通过再分离，可从感染猪的BALF中再分离出Mhyo病原。这些结果表明，建立了巴马小型猪的猪支原体肺炎感染模型，并显示出与大型家猪中观察到的猪支原体肺炎一致的临床症状和病理损伤。

主要参考文献

Maes,D.,Sibila,M.,Kuhnert,P.,Segales,J.,Haesebrouck,F.,Pieters,M.,.UpdateonMycoplasmahyopneumoniaeinfectionsinpigs:Knowledgegapsforimproveddiseasecontrol.Transbound.Emerg.Dis65Suppl1,-.

Bai,Y.,Gan,Y.,Hua,L.Z.,Nathues,H.,Yang,H.,Wei,Y.N.,Wu,M.,Shao,G.Q.,Feng,Z.X.,.ApplicationofasIgA-ELISAmethodfordifferentiationofMycoplasmahyopneumoniaeinfectedfromvaccinatedpigs.Vet.Microbiol,86-92.

Xiong,Q.,Wei,Y.,Feng,Z.,Gan,Y.,Liu,Z.,Liu,M.,Bai,F.,Shao,G.,.ProtectiveefficacyofaliveattenuatedMycoplasmahyopneumoniaevaccinewithanISCOM-matrixadjuvantinpigs.

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猪鼻支原体烯醇化酶的黏附细胞功能及其在致病中的可能作用

王佳潘垄基冯志新邵国青熊祺琰*

(江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，)

目的猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis,Mhr)是猪呼吸道常在菌，临床生产中感染率极高。其在一定情况下可引起仔猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎等症状，导致猪群生产性能下降，被欧美国家认定为一种造成显著经济损失的新生疾病。但目前关于Mhr的发病机制研究和疫苗开发都相对落后。本文主要研究了Mhr的烯醇化酶(Enolase)对宿主细胞的黏附能力及与纤溶酶原（Plg）的结合能力，从而初步阐述其在Mhr致病过程中的可能作用。材料与方法根据已经公布的Mhr烯醇化酶的基因序列，进行密码子优化和基因合成，将合成后的目的基因装入pET-28a(+)原核表达载体构建重组表达质粒，转化大肠杆菌获得重组工程菌。通过诱导表达及镍柱亲和层析获得纯化的Mhr-Eno重组蛋白。利用间接免疫荧光法鉴定该重组蛋白对宿主细胞的黏附能力；同时利用Far-Westernblot方法鉴定Mhr-Eno与Plg之间的相互作用，以探讨烯醇化酶在激活纤溶系统帮助Mhr形成系统性感染中的可能作用。结果与讨论本研究成功构建了含有Mhr-Eno基因的重组质粒，转化大肠杆菌，筛选获得了阳性重组菌，诱导表达并成功纯化了Mhr-Eno重组蛋白。支原体为膜相关病原菌，黏附因子对于支原体感染具有重要作用。目前已知的Mhr黏附因子仅有可变脂蛋白(Vlp)家族和P37蛋白。本研究通过间接免疫荧光试验证明Mhr-Eno蛋白可显著黏附于气管上皮细胞，表明烯醇化酶为Mhr的黏附因子之一。Mhr主要引发猪全身系统性病变，因此Mhr由呼吸道感染后突破上呼吸道屏障向全身散播是其致病的关键。纤溶系统在细菌的组织侵袭中具有重要作用，本研究利用Far-Westrenblot方法鉴定了Mhr-Eno重组蛋白与Plg之间的相互作用，发现Mhr-Eno可与Plg结合。该结果提示Mhr可以利用烯醇化酶来募集宿主体内的Plg，激活纤溶系统，从而帮助其突破细胞屏障移行至全身。综上，我们成功构建了Mhr的烯醇化酶重组蛋白，并对该蛋白的黏附细胞能力和结合Plg能力进行了鉴定，为猪鼻支原体致病机制研究提供了启示。

主要参考文献

[1]BMartinson,FCMinion,DJordan:Developmentandoptimizationofacell-associatedchallengemodelforMycoplasmahyorhinisin7-week-oldcesarean-derived,colostrum-deprivedpigs.CanJVetRes,82:12-23.

[2]QXiong,JWang,YJi,BNi,BZhang,QMa,YWei,SXiao,ZFeng,MLiu,etal:ThefunctionsofthevariablelipoproteinfamilyofMycoplasmahyorhinisinadherencetohostcells.VetMicrobiol,:82-9.

[3]SBhattacharya,VAPloplis,FJCastellino:Bacterialplasminogenreceptorsutilizehostplasminogensystemforeffectiveinvasionanddissemination.JBiomedBiotechnol,:.

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猪肺炎支原体毒力因子挖掘与致病机制研究

于岩飞，陈蓉，倪博，熊祺琰，刘茂军，邵国青，冯志新*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言猪喘气病是由猪肺炎支原体（Mhyo）引起的一种慢性、接触性呼吸道传染病，难以防控与净化。但目前对其致病机制的研究尚不全面，尤其是对毒力因子更是缺乏了解。本研究采用多种组学结合的方法进行毒力因子的筛选。材料与方法首先用双向电泳技术对体外无细胞培养的Mhyo强弱毒菌株进行比较蛋白组学分析，进一步比较体外无细胞培养和靶细胞感染培养的Mhyo强毒菌株的全菌蛋白组，最后通过对已有的9株Mhyo全基因组序列进行泛基因组和核心基因组分析。结合差异蛋白组和基因组结果，综合筛选毒力相关因子，并鉴定其功能。结果与讨论在比较蛋白组学的分析中，我们发现7个蛋白在强毒株中表达显著上调，6个蛋白在感染猪气管上皮细胞后表达显著上调。泛基因组学分析发现这些差异蛋白大多由核心基因组编码，属于基因组中的固有成分，但同时又能参与致病过程，这种兼职蛋白对于基因组较小的支原体更好地发挥基因组的功能具有重要的意义。蛋白互作网络分析发现这些差异蛋白与目前报道的毒力因子之间存在互作关系，其中一个重要节点热不稳定延伸因子EF-Tu，除了在蛋白合成中发挥作用外，还定位于Mhyo表面，通过结合纤连蛋白发挥黏附功能[1]。同样，另一个重要的表面黏附素果糖-二磷酸醛缩酶FBA也可以通过与胞外基质的结合发挥黏附作用[2]。这类黏附蛋白可能在Mhyo定植到猪呼吸道表面发挥重要功能。另一类差异蛋白则可能在侵入细胞的过程中发挥作用。如烯醇酶Enolase可以以极高的亲和力结合纤溶酶原，可能通过激活后者参与呼吸道屏障的破坏过程[3]。还有一类蛋白与细胞凋亡、炎症产生有关。如脂质相关膜蛋白LAMPs通过诱导NO、超氧阴离子的产生和Caspase-3的活化诱导猪肺泡巨噬细胞的凋亡，还可通过p38MAPK和Bax/Bcl-2信号通路诱导促炎细胞因子和活性氧（ROS）的产生以及猪外周血单核细胞（PBMCs）的凋亡[4,5]。此外，我们还首次发现Mhyo可能存在逃避补体系统活化的免疫逃逸机制。Mhyo结合补体中的重要负反馈调节因子H因子后，其在血清中的存活能力出现显著提高。综上，关于Mhyo黏附、侵入、促炎及免疫逃逸等机制我们做了初步探索，我们正在构建Mhyo基因编辑平台及猪呼吸道上皮细胞体外3D模型，将为Mhyo毒力因子的鉴定发挥重要作用。

主要参考文献

Bai,F.,Ni,B.,Liu,M.,Feng,Z.,Xiong,Q.,Shao,G.,,Mycoplasmahyopneumoniae-derivedlipid-associatedmembraneproteinsinduceinflammationandapoptosisinporcineperipheralbloodmononuclearcellsinvitro.VetMicrobiol,58-67.

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用于猪肺炎支原体体外黏附模型的猪气管上皮永生化细胞的构建

谢星，郝飞，甘源，王海燕，张磊，刘蓓蓓，韦艳娜，邵国青，熊祺琰，冯志新*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言猪肺炎支原体（Mhyo）是引起猪气喘病的主要病原，沿着猪呼吸道上皮细胞的纤毛的黏附是其成功感染的前提。其主要寄居于猪气管黏膜表面，引起纤毛停滞和脱落，并易与其他猪呼吸道病原混合或继发感染，引发猪呼吸道疾病综合征，使得感染猪产生慢性持续性呼吸系统疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。原代猪气管上皮细胞（PTECs）是研究多种猪呼吸道病原致病机制的理想体外感染模型，但原代细胞短暂的寿命极大限制了其应用前景。因此，构建用于Mhyo体外黏附模型的猪气管上皮永生化细胞具有很高的应用价值。材料与方法用改造后的含有人端粒酶逆转录酶（hTERT）的pEGFP-hTERT重组质粒转染原代PTECs，通过两轮G的抗性筛选，初步建立永生化的猪气管上皮细胞系（hTERT-PTECs），并可传代至60代以上。通过比较原代与永生化细胞的上皮细胞表面标志物角蛋白18的表达，细胞周期，细胞生长曲线，端粒酶活性，染色体核型分析，端粒酶基因的蛋白质印记检测，软琼脂和裸鼠成瘤试验，增殖能力等相关基因的定量PCR检测，验证其是否具备原代细胞的形态及功能特性。将不同的Mhyo菌株感染hTERT-PTECs，通过对MhyoP97抗原的间免定性检测，蛋白质印记及感染后的Mhyo的定量测定，验证其是否可作为Mhyo的体外黏附细胞模型。结果与讨论HTERT-PTECs保留了原代细胞的形态和功能，并具有延长的复制寿命，更高的端粒酶活性及更强的增殖活性。其不在体外转化，也不在裸鼠体内表现出恶性表型，表明其不具有致瘤性。永生化细胞对Mhyo易感，可作为Mhyo感染的细胞黏附模型。总之，构建的永生化细胞hTERT-PTECs可作为包括Mhyo等猪呼吸道病原的体外细胞感染模型应用。

主要参考文献

XieX,PangM,LiangS,YuL,ZhaoY,MaK,KalhoroDH,LuC,LiuY.Establishmentandcharacterizationofatelomerase-immortalizedcaninebronchiolarepithelialcellline.ApplMicrobiolBiotechnol..99(21):-.

XieX,GanY,PangM,ShaoG,ZhangL,LiuB,XuQ,WangH,FengY,YuY,ChenR,WuM,ZhangZ,HuaL,XiongQ,LiuM,FengZ.Establishmentandcharacterizationofatelomerase-immortalizedporcinebronchialepithelialcellline.JCellPhysiol..(12):-.

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猪肺炎支原体巢式PCR检测方法的建立及应用

栾璐，何海蓉

（中崇信诺生物科技泰州有限公司，江苏泰州，）

引言猪支原体肺炎（MPS）是由猪肺炎支原体（Mhp）引起的慢性呼吸道传染病，临床症状为咳嗽，气喘，料肉比转化率低。该病发病率高，死亡率低，是造成养猪行业严重经济损失的疾病之一[1]。诊断检测Mhp方法有分离培养法、免疫荧光法、聚合酶链式反应（PCR）等，但费时费力、特异性和敏感性不高。而巢式PCR的优点是增加扩增倍数，减少非特异性反应，提高特异性和敏感度[2]。MhpP36基因能够编码乳酸脱氢酶蛋白（LDH），LDH是Mhp的特异性免疫优势蛋白，具有保守和种族特异性，能够诱导早期免疫反应[3]。根据MhpP36基因序列，设计并建立猪肺炎支原体巢式PCR检测方法，对快速检测Mhp具有重要意义。材料与方法根据MhpP36基因序列，用Clustal多重序列比对软件对比设计引物，建立猪肺炎支原体巢式PCR检测方法。用鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒验证其特异性。Mhp株阳性培养液梯度稀释，验证其敏感性。并应用该巢式PCR检测方法，对50份待测培养基进行Mhp检测，检测其培养基是否感染猪肺炎支原体。结果与讨论比对MhpP36基因序列，建立猪肺炎支原体巢式PCR检测方法，能扩增出bp和bp内外套扩增带，且最低检测限度为10个CUU（颜色变化单位）。应用该巢式PCR检测方法，其他病毒未扩增出相应片段。对50份待测培养基进行Mhp检测，结果表明，44份阳性，6份阴性，阳性率为88%。分析Mhp九个标准株的P36基因核酸和编码蛋白质，结果表明，其同源性高，编码蛋白同源性基本上为88.89%。该猪肺炎支原体巢式PCR检测方法，省时省力，特异性更高和敏感性更强，对快速检测Mhp具有良好的诊断技术应用价值和临床试验价值。

主要参考文献

[1]LiuW,FengZ,FangL,etal.CompleteGenomeSequenceofMycoplasmahyopneumoniaeStrain[J].Journalofbacteriology,,(4):-.

[2]MinionFC,LefkowitzEJ,MadsenML,etal.TheGenomeSequenceofMycoplasmahyopneumoniaeStrain,theAgentofSwineMycoplasmosis[J].Journalofbacteriology,,(21):-.

[3]LiuW,XiaoS,LiM,etal.ComparativegenomicanalysesofMycoplasmahyopneumoniaepathogenicstrainanditshigh-passagedattenuatedstrain[J].BioMedCentralGenomics,,14:80-92.

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猪支气管上皮细胞气液培养系统的建立及在猪肺炎支原体感染中的应用

王海燕,张珍珍,谢星,韦艳娜,袁厅,张磊,熊祺琰,邵国青，冯志新*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言气液培养（Ali）可使细胞体外培养具备体内特征，兼具实验动物和传代细胞的优点。猪肺炎支原体(Mhyo)是猪呼吸道的重要病原，由于缺乏合适的体外感染模型，其致病机制尚不清晰。因此，本研究建立了猪支气管上皮细胞气液培养系统（Ali-PBEC），借助该系统建立了Mhyo体外感染损伤模型，为Mhyo乃至猪呼吸道病原的致病机制研究提供重要平台。材料和方法分离原代PBEC，进行气液培养。利用?-tubullin抗体检测纤毛分布。利用组织切片、电镜技术对细胞的结构、形态进行鉴定，并与体内支气管进行比较。最终建立猪支气管上皮细胞气液培养系统。将Mhyo接种至Ali-PBEC中，对嵌皿下层培养基中的Mhyo含量进行动态检测。同时，借助激光共聚焦扫描，系统检测细胞复层中的Mhyo、纤毛、紧密连接以及粘液的动态变化。最终建立Mhyo体外感染、损伤模型。结果与讨论本研究成功建立猪支气管上皮细胞气液培养系统。D14天起，细胞表面显著可见摆动纤毛;?-tubullin染色结果表明，90%以上区域覆盖有簇状纤毛。透射电镜结果表明，细胞表面可形成紧密连接；摆动纤毛为（9+2）双微管结构，为运动型纤毛。扫描电镜和组织切片结果表明，Ali-PBEC具备与体内类似的假复层结构和细胞组成。在此基础上，建立了Mhyo体外感染和损伤模型。Mhyo可黏附至细胞表面，并逐渐侵入黏膜下层。同时，Mhyo感染可引起纤毛的聚集、凌乱和脱落，细胞复层结构重排，细胞厚度和电阻显著降低，并破坏紧密连接，引起粘液分布不均。随着感染时间的增加，除纤毛损伤外，其余屏障损伤均可恢复。综上，Mhyo可通过破坏和损伤呼吸道黏膜屏障而侵入黏膜下层，黏膜屏障也具备自我修复的功能。该培养系统和感染模型为Mhyo乃至呼吸道病原致病机制研究提供重要的平台和依据。

主要参考文献

[1]Princeetal.ModelingPersistentMycoplasmapneumoniaeInfectionofHumanAirwayEpithelium.CellularMicrobiology,,20(3).

[2]Ranmondetal.Mycoplasmahyopneumoniaeresidesintracellularlywithinporcineepithelialcells.Scientificreports.,8(1):.

[3]Weitnaueretal.Controloflocalimmunitybyairwayepithelialcells.MucosalImmunology.,9(2):-98.

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影响猪肺炎支原体培养的相关因素分析

王丽、韦艳娜、袁厅、杨浩、熊祺琰、冯志新*、邵国青*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言猪支原体肺炎的病原为猪肺炎支原体（Mhyo），本病广泛存在于世界各国，是造成养猪业经济损失的重要传染病之一。Mhyo的培养相对困难，影响因素较多。本研究主要针对血清中特异性抗体存在与否、血清处理方式、培养基及菌种的保存条件等几项因素对Mhyo培养滴度的影响进行试验分析，为Mhyo体外培养提供数据参考。材料和方法利用半数颜色变化单位（CCU50）的方法对不同条件培养的Mhyo株进行滴度测定，观察不同因素对Mhyo培养的影响。主要包括：比较血清Mhyo抗体阴阳性、灭能与否、反复冻融与否对Mhyo培养的影响；比较KM2培养基的保存方式对Mhyo培养的影响；比较Mhyo菌种的保存方式对滴度的影响。结果与讨论1.血清对Mhyo培养的影响对血清进行56℃灭能及反复冻融处理，结果显示血清灭能、反复冻融（≦5次）对Mhyo培养滴度的影响不显著。对不同批次血清中的Mhyo抗体进行检测，同时用于培养Mhyo株，比较结果显示，阴性血清及阳性血清均可培养Mhyo，阴性血清培养效果更理想（93.97%的阴性血清培养Mhyo株滴度均达.5CCU50/mL或以上）。2.KM2培养基保存方式对Mhyo培养的影响KM2培养基放置4℃保存，3个月内培养Mhyo株的滴度稳定不变；放置-20℃保存，4年内培养滴度稳定不变；将KM2培养基反复冻融3次，培养Mhyo株滴度均稳定。3.Mhyo菌种保存方式对滴度的影响将Mhyo株菌种放置4℃保存，随着保存时间的增加滴度逐步降低，但菌种至少可存活15d；放置-20℃可保存6个月，滴度保持稳定，至少可存活2年；放置-70℃保存，至少3年滴度稳定不变。本研究为Mhyo培养基及Mhyo培养物的生产和保存提供了重要的数据参考。

主要参考文献

[1]郑铁鑫,张影,柴华等.猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究[J].兽医导刊,,(11).

[2]韦艳娜,熊祺琰,刘茂军等.不同因素对猪肺炎支原体颜色变化单位测定的影响[J].中国兽药杂志,,(8).

[3]罗玉峰，朱良全，冯娟，等.支原体检验用培养基的研究[J].中国兽药杂志，,43(6):26-29.

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猪肺炎支原体高效培养基研制

韦艳娜、王丽、刘蓓蓓、熊祺琰、冯志新*、邵国青*

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，）

引言猪肺炎支原体（Mhyo）引起的猪支原体肺炎遍布世界各地，是国际养猪业

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