NatureCellBiology

　

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年9月美国匹兹堡大学医学院匹兹堡肝脏研究中心学者MoR.Ebrahimkhani与SamiraKiani于NatureCellBiology发表文章SyntheticimmunomodulationwithaCRISPRsuper-repressorinvivo其研究证明了基于CRISPR的转录调节作为一种易于编程的工具来调节炎症条件和保护免受感染条件的前景。Cas9核酸酶和截断gRNA在这项研究中可以同时应用CRISPR靶向基因编辑及调节免疫反应,这使得CRISPR介导基因压制优于其他系统。

最近重新利用有规律的间隔短回文重复(CRISPR)系统进行转录调节，在转录水平打开了无数的治疗机会。对免疫相关基因的转录控制可以为人类的各种急性或慢性炎症以及大流行病时的传染病提供一种通用的治疗方式。此外，这种控制为生物发现提供了一种强有力的手段。然而，尽管潜力巨大，在体内翻译CRISPR转录工具的研究有限，而探索该系统抑制转录的效用的研究则少之又少。以前CRISPR-based体内转录阻遏物操作基于催化地deadCas9蛋白质(dCas9)融合Kruppel-associated盒域。可用的基因工程平台应该采用基因转录控制和编辑需求允许高水平的控制在DNA和RNA水平(例如,同时调节免疫反应),可以实现通过改变指导RNA(gRNAs)的长度。然而，尚不清楚的是，截断的gRNAs是否能够在体内提供合成抑制转录的有效手段，从而导致生理相关的表型。

作者开始确定在体内使用基于CRISPR的增强转录抑制因子是否可以实现合成免疫调节。骨髓分化响应MyD88是先天和适应性免疫反应的一个关键节点,充当一个重要的衔接分子的信号通路。MYD88激活的突变与许多淋巴恶性肿瘤有关，特别是Waldenstrom大球蛋白血症和活化的b细胞弥漫性大b细胞淋巴瘤。鉴于MyD88信号在先天免疫和适应性免疫中的核心作用，试图在体内检测该位点的合成转录调节。

图1：体外Aptamer介导的CRISPR抑制。

CRISPR介导的MS2-HP1a-KRAB在体外抑制优于MS2-KRAB。作者之前报道了体外增强的基于CRISPR的转录抑制因子，是通过一系列调节因子直接融合催化死亡Cas9蛋白(MeCP2,MBD2或异染色质蛋白1(HP1a)18而开发的。作者首先设计实验，以确定在融合到MS2外壳蛋白(此处称为MS2)并通过gRNA适配体结合被招募到CRISPR复合物时，候选基因中的哪些转录抑制结构域能够导致有效的转录抑制(图1a)。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析了人胚胎肾(HEKFT)细胞中的一组靶基因，发现MS2-HP1a-KRAB能有效抑制作者测试的所有基因(图1b)。为了在体内转化这些发现，作者开始利用核酶感受态化脓性链球菌(Sp)Cas9转基因小鼠，因为它们使作者能够消除与Cas9传递相关的潜在混淆效应。因此，作者设计了一对截断的gRNAs，它们靶向Cas9核酸酶和MS2-HP1a-KRAB到Myd88启动子(图1c)。这一策略允许Cas9核酸酶被重新用于核酸酶缺失蛋白的转录抑制。作者首先比较了小鼠神经母细胞瘤(N2A)细胞中截断的gRNA与全长gRNA的功能(图1c)。RNA测序显示，使用截断的gRNA进行转录抑制与传统的基于20nt的gRNA进行体外抑制一样有效和特异性(图1d,e)。此外，该策略在体外对Myd88位点的抑制效果与dCas9和HP1a-KRAB水平相当时的dCas9-HP1a-KRAB融合蛋白相似。接下来，作者在体外检测了ms2-hp1a-kbs介导的内源性小鼠Myd88水平的抑制，并与常用的基于kbs的转录抑制进行了比较。作者使用先前报道的非靶向模拟gRNA作为对照。Myd88的qRT-PCR显示了gRNAs的体外功能，以及MS2-HP1a-KRAB在抑制内源性Myd88方面的优势(图1f)。

图2：在体外和体内基于crispr的靶向Myd88抑制使用MS2阻遏物

在体内，通过招募MS2-HP1a-KRAB到gRNA，可以有效地实现CRISPR介导的Myd88位点的抑制。为了在体内测试这种抑制因子，作者在AAVs中通过包装gRNAs和ms2抑制盒进行传递。不同的AAV血清型已被用于体内传递CRISPR。最常见的血清型是AAV9，它与实质细胞增殖有很高的亲和力。在这里，作者使用了一个杂交的AAV2/1血清型，这是一个重组的AAV，由AAV2末端反向重复，和AAV1Rep和Cap基因(这里为简单起见，简称AAV1)组成。AAV1已被证明在免疫系统成分和非实质细胞如树突细胞和内皮细胞的转导中是有效的。此外，AAV1衣壳可以诱导MyD88信号，这是免疫AAVs的途径之一。作者对AAV1组织亲和性的评估显示，AAV1/Myd88gRNA在血液、肺和骨髓中表达最高。随后，作者将AAV1/Myd88gRNA或用MS2-HP1a-KRAB或MS2-KRAB盒控制AAV1/MockgRNA，全身递送至Cas9核酸酶转基因小鼠(图2a)。注射三周后，收集血液、肺和骨髓，采用qRT-PCR检测Myd88的表达情况(图2b)。与未注射对照组相比，AAV分娩导致了作者测试的不同组织中Myd88的增加。用CRISPR处理HP1a-KRAB抑制内源性Myd88，与空白grna处理组相比，在血液中(84%)、肺中(75%)和骨髓中(63%)Myd88的水平显著降低，这与AAV1对这些组织的高亲和力相一致。单独使用KRAB结构域可导致肺(52%)、血液(59%)和骨髓(34%)中Myd88的抑制较不明显，在被测动物中差异略高(图2b)。

为了评估重组下游基因调控网络的抑制效果，作者评估了MyD88信号通路直接调控的两种信号元件——肿瘤坏死因子(TNF-TNF-)和细胞间黏着分子-1(ICAM-1)的水平。Myd88定位和MS2-HP1a-KRAB导致显著减少Icam-1跨多个组织和肿瘤坏死因子α表达,而针对MS2-KRAB并未导致类似的一致性影响(图2c,d),进行系统性的评估镇压MS2-HP1a-KRAB系统的效率与MS2-KRAB相比,作者对小鼠的骨髓进行下一代RNA序列处理这些结构。经ms2-hp1a-krabm处理的小鼠比经ms2-krabm处理的小鼠表达更低的Myd88水平，这伴随着下游信号通路的改变，如Il1调节蛋白。值得注意的是，GO富集分析显示，MyD88-ms2-hp1a-krabb处理的小鼠对免疫和防御外来生物体和细菌反应的信号通路有显著下调，这些通路与MyD88功能相关。同样，反应体数据库显示，TLR通路是存在MS2-HP1a-KRAB的主要下调通路之一。这表明在体内，MS2-HP1a-KRAB阻遏物对Myd88及其下游免疫通路的调节最为有效。

有趣的是，差异表达基因的火山图显示，免疫球蛋白G1和G2(Ighg1和Ighg2b)的重链是恒定区域，而其他与免疫球蛋白相关的重链和轻链基因最多下调HP1a-KRAB相对于KRAB(图2e)。鉴于小鼠的遗传背景(C57BL/6)，这是一个有趣的发现，小鼠的遗传背景(C57BL/6)已被证明产生高水平的IgGs36。

图3：体内预防性注射AAV1/MyD88可导致对AAV的体液免疫调节

CRISPR介导的Myd88抑制导致对AAV介导的基因治疗的体液反应的调节及其功能的有效性。之前的研究已经证明了这种病毒DNA刺激TLR(即TLR9)，进而激活MyD88并启动下游信号事件，导致适应性免疫和抗AAVs8、16的抗体生成。早些时候的证据和观察到的镇压的免疫球蛋白通路,作者问是否有减少AAV-specific体液反应后治疗AAV1携带Myd88-targetinggRNAs和MS2-HP1a-KRAB(这里称为AAV1/Myd88)相比,控制病毒携带模拟gRNAs(AAV1/模拟)。注射三周后，作者测量了IgG对AAV1衣壳的反应。作者检测到AAV1/Myd88组与AAV1/mock处理的动物相比，AAV1/Myd88组动物的血浆IgG2a水平降低了50%(图3a)。针对AAV衣壳的抗体形成是再次进行基于AAV的基因治疗的一个重要障碍，通常会导致病毒的快速清除和其他与病毒或被免疫系统破坏的细胞相关的有害影响。为了进一步探讨Myd88抑制对AAV1再给药后体液免疫调节的预防作用，作者询问AAV1/Myd88预处理是否会影响再给AAV1/Mock后对AAV1的IgG水平。对血浆中IgG1和IgG2A的分析显示，在最初的Myd88抑制后，IgG1和IgG2A水平较低，这暗示了该策略在调节再给药AAV1的体液反应方面的潜力(图3b)。

为了检验这种策略调节对其他AAV血清型反应的可扩展性，作者用AAV1/Myd88或AAV1/Mock对小鼠进行预处理，并在7天后系统注射携带LacZ或Cas9葡萄球菌(SaCas9)盒的AAV9。在这两种情况下，对抗AAV9的IgG总水平的分析表明，Myd88的抑制导致抗AAV9的抗体应答降低。此外，这还伴随着血液中SaCas9抗体的显著降低和LacZ转录水平的升高(图3c,d)。这些数据表明，通过抑制Myd88调节免疫球蛋白的产生可以影响对多种AAV血清型及其货物的体液反应。在这种情况下，血液中LacZ的高表达暗示了使用这种方法的基因治疗可能具有更高的效率。

为了在CRISPR疗法的背景下进一步探索这一概念，作者先用AAV1/Myd88或AAV1/Mock对小鼠进行预处理，然后分别对小鼠进行为期7天和14天的两轮基于AAV9的基因治疗(图3e)。在本例中，AAV9携带一盒CRISPR介导的抑制前蛋白转化酶枯叶菌素/kexintype9(PCSK9)的盒式磁带，类似于作者抑制Myd88的策略。PCSK9是由PCSK9基因编码的一种酶。这种酶与肝细胞表面的低密度脂蛋白(LDL)受体结合，并开始摄入LDL受体。因此，当PCSK9被阻断或抑制时，会出现更多的LDL受体将LDL从血液中移除，从而降低血液中LDL-胆固醇水平。这种酶是之前体内CRISPR应用的靶点。作者的数据显示，与对照组相比，AAV1/Myd88预处理组Myd88表达降低，IgG1和IgG总水平降低(图3f)。这一观察结果伴随着更好的PCSK9抑制和更低的血浆胆固醇水平，表明基因治疗的效率提高了(图3g,h)。总之，这些数据提供了一个令人兴奋的机会来调节对抗AAV的体液免疫，可能是通过使用一种天生适合执行基因编辑和表观遗传调节(核酸酶敏感CRISPR)的工具来预防性抑制Myd88。

图4：对AAV/Myd88抑制的体内远期疗效

从长期来看，CRISPR介导的Myd88抑制不会产生明显的负面影响。接下来，作者探讨了AAV1/Myd88抑制在体内的长期疗效，以进一步评估其持久性和可能的负面影响。注射23周后，对肺、血液和骨髓中Myd88转录本的分析显示，AAV1/Myd88组Myd88抑制(图4a)。为了评估MyD88水平长期降低可能带来的负面影响，作者分析了一些主要脏器功能的关键指标，包括肾脏的尿素氮(BUN)，肝脏的丙氨酸转氨酶(ALT)和白蛋白，胰腺的脂肪酶，以及作为组织损伤标志物的乳酸脱氢酶(LDH)。与模拟处理组相比，这些标记均无显著差异(图4b)。此外，对小鼠体重的追踪表明，由于所有动物的体重都具有可比性，因此对一般健康和福祉没有可检测到的有害影响(图4c)。

图5：基于crispr的宿主炎症反应调节可以作为Cas9转基因和WT小鼠中lps介导的败血症的预防措施。

在体内CRISPR介导的Myd88抑制可以作为Cas9转基因和C57BL/6小鼠败血症的预防措施。接下来作者询问当有增强的全身免疫反应时，这种策略是否可以作为一种预防败血症的方式。由于抗生素耐药性的出现和慢性病患者寿命的延长，败血症是一个紧迫的医学问题。此外，战场创伤后败血症造成的高死亡率仍然是医学上的一大挑战，这突出表明需要制定新的预防战略。作者用AAV1/Myd88或AAV1/Mock对Cas9小鼠进行预处理，三周后将其置于系统性LPS处理。LPS后6小时，作者收集了肺、血液和骨髓，评估了Myd88和主要炎症细胞因子的转录水平(图5a)。与AAV1/mock处理的小鼠相比，作者观察到肺(61%)、血液(80%)和骨髓(76%)Myd88明显受到抑制(图5b)。在LPS暴露前，小鼠经AAV1/Myd88抑制盒预处理后，血浆乳酸水平与败血症和组织损伤相关的系统性标记物显著降低，表明系统性损伤减少(图5c)。此外,Myd88压迫阻止upregulation广泛的炎症和免疫相关细胞因子直接或间接的下游Myd88信号,如Icam-1、肿瘤坏死因子α,Ncf,白介素、干扰素-α干扰素-β干扰素-γ和Stat4(图5d)。使用定量分析血浆和肺细胞因子水平ELISA-based化学发光分析显示低水平的细胞因子在Myd88-repressed老鼠(图5e)。

图6：通过AAV1/Cas9和AAV1携带gRNA-MS2-HP1a-KRAB的双AAVCRISPR/Cas9策略，在脂多糖介导的败血症中发挥保护作用。

为了探讨作者是否可以通过同时向野生型动物递送Cas9和gRNA-MS2-HP1a-KRAB盒来达到类似的结果，作者检测了一种双AAV1系统，其中第二种病毒携带Sp-Cas9核酸酶盒(图6a)。该策略能够降低C57BL/6小鼠的Myd88转录本，无论是否存在败血症，导致类似于作者在Cas9转基因动物中观察到的表型相关反应(图6bd)。

在暴露于脂多糖后，纳米颗粒介导的靶向CRISPR超抑制因子Myd88的传递可以作为一种治疗败血症的方式。为了检验暴露于LPS后该方法的治疗潜力，作者试图通过纳米颗粒的方法将CRISPR质粒递送至C57BL/6,与基于AAV的系统相比，它们使基于CRISPR的基因调制传输速度更快、更可行。考虑到LPS暴露后肝脏损伤的重要性，以及输送的大部分纳米颗粒系统地在肝脏和肺中积累，作者重点研究了肝脏。作者首先检测了AAV1/Myd88是否能抑制肝脏中Myd88的表达。由于目前的一对gRNAs难以抑制肝脏中的Myd88，作者设计了另一对针对Myd88启动子的不同区域的gRNAs。在AAV介导的传递过程中，新的gRNAs导致肝脏Myd88的抑制Cas9转基因小鼠。在LPS损伤后也可以观察到这种情况。

图7:治疗递送携带DNA编码myd88靶向CRISPR的纳米颗粒对脂多糖介导的败血症具有保护作用

接下来，作者研究了该系统对LPS暴露2h后C57BL/6小鼠的治疗效果。作者给小鼠注射了携带Cas9、gRNAs和MS2-HP1a-KRAB的纳米颗粒，并检测了对脂多糖的全身炎症反应(图7a)。CRISPR释放72小时后，收集血液、肺、肝和骨髓，采用qRT-PCR检测Myd88表达。与模拟处理组相比，处理导致血液、肺、骨髓和肝脏中Myd88的水平下降(图7b)。这种Myd88抑制抑制了LPS暴露后一系列炎症标志物的上调(图7c)。肝脏组织损伤的血浆标记物分析表明，作者可以调节LPS注射的有害影响(图7d)。特别是，高密度脂蛋白(HDL)已被证明在LPS治疗后会增加，以消除全身性LPS，从而保护组织免受损伤，并与MyD88信号有关。根据这一点，作者发现与模拟处理组相比，Myd88抑制降低了HDL、LDL和胆固醇。此外，Myd88抑制降低了ALT和天门冬氨酸转氨酶(AST)，这两个肝细胞损伤的标记物，进一步表明该方法可以有效的治疗(图7d)。

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