超薄型琼脂糖凝胶板的制作及血清蛋白电泳方

上海迪安医学检验所研发实验室：王月婷，陆桂琴，苏照环，于嘉屏

摘要：

目的：制作超薄型琼脂糖凝胶板并建立血清蛋白电泳检测方法。方法采用软玻璃及透明胶片自制胶板模具；采用透明胶片刻制加样膜条；恒压65V电泳分离血清蛋白。

结果：所配制的琼脂糖凝胶板厚度小于0.8mm；一块板同时可分析8个样品；各蛋白区带的批内CV值小于16％，批间CV值小于27％；名体检正常人血清的参考范围为：清蛋白53.1％～70.3％、α1-球蛋白0.9％～3.5％、α2-球蛋白3.5％～8.9％、β-球蛋白7.1％～14.3％和γ-球蛋白13.0％～25.4％。

结论：自制的超薄型琼脂糖凝胶电泳板能清晰分离血清中5类蛋白质，染色脱色时问短，背景清楚，性能指标稳定，可用于血清蛋白的分离及检测。

血清蛋白电泳是检测血清蛋白质类的常用方法，其电泳图谱可了解患者血清蛋白质全貌，用于初筛试验，为疾病诊断提供较全面的信息。目前各医疗机构检验科应用的方法大多为国外的全自动电泳仪，价格昂贵，分析成本很高口。醋酸纤维素薄膜电泳存在灵敏度差，重复性不佳等缺点，且图谱难以保存。本文报道了一种超薄型琼脂糖凝胶板的制作方法并用于血清蛋白电泳检测，价格低廉，操作简便，医院检验科应用。

1、材料与方法

1.1样品来源：收集各个年龄段体检正常的人血清样品，当天检测。

1.2仪器与试剂JYC型电泳仪，JY-SP7型电泳槽，JY04S-3C凝胶成像分析系统（北京君意东方电泳设备公司）。凝胶缓冲液：pH8.6三羟甲基氨基甲烷缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷1.g，EDTA0.29g，NaCl15.85g，调pH值至8.6，去离子水定容至mL。电极缓冲液：pH8.6巴比妥缓冲液，离子强度为0.。称取巴比妥2.76g，巴比妥钠15.4g，EDTA0.29g，调pH值至8.6，去离子水定容至mL。琼脂糖凝胶板：0.65％的琼脂糖凝胶。称取琼脂糖0.65g，溶于50mL的凝胶缓冲液，去离子水定容至mL。氨基黑10B染液：称取氨基黑10B0.1g，溶于无水乙醇20mL中，加冰乙酸5mL，甘油0.5mL使其溶解。再称取磺基水杨酸2.5g，溶于少量去离子水中，加入前液。最后去离子水定容至mL。脱色液：甲醇45mL，冰乙酸5mL，去离子水定容至mL。

1.4方法

1.4.1模具及胶板的制作：取一块长20cm、宽15cm、厚0.8mm的台面软玻璃，将中央长9.5cm、宽6.5cm的面积裁空，下衬10cm×7cm的透明胶片，胶片需紧贴挖空部分的边缘，不能漏胶。将沸水浴融化后的琼脂糖凝胶冷却至60℃左右，倒在模具的胶片上，用载玻片从裁空的一边拉向另一边，使凝胶均匀布满整个胶片，防止气泡产生。待凝胶凝固后，用小刀沿中空软玻璃边缘分离凝胶，之后从一端将软玻璃模具小心的揭除，即完成凝胶板的制作。再将一裁成与胶板同样大小的保鲜薄膜贴于凝胶板上，放置塑料盒中，放2～8℃冰箱待用。

1.4.2加样模条的制作：取一长17cm、宽2cm的透明胶片，在其中央用手术刀片等间距刻长4mm，宽0.8mm共计8个加样微孔，孔间距约3mm。

1.4.3电泳操作：

（1）从冰箱取出凝胶板，恢复至室温后，在距凝胶板一侧的边缘约1cm处覆盖一条宽为2cm的滤纸条，吸去多余水分，然后将加样膜条置于其上并使其紧贴胶板，避免气泡产生。将2μl血清样品加入孔中，注意使加入的样品均匀的充满孔内，静置5min，待血清样品扩散进入胶内，用一条新的滤纸条覆盖于加样孔膜上，吸去多余的样品，然后除去加样孔膜。

（2）将琼脂糖凝胶板放在电泳槽上，加样侧置于阴极，两端用八层纱布搭桥，电泳条件为恒压65V，时间30min。

（3）电泳毕，取出凝胶板，氨基黑10B染色20min。再置于脱色液中脱色至背景干净为止。（4）把脱色干净的凝胶板置于全自动凝胶成像分析仪下扫描，计算各条带的光密度百分比。

2、结果

2.1电泳图谱：超薄型琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白图谱，见图1。

图1超薄型琼脂糖凝胶分离血清蛋白条带图谱

2.2批内精密度试验：取同一份血清在同一张凝胶板上点样8份，电泳后扫描求得结果。分别计算平均值(`χ)，标准差(s)，变异系数(CV)。如表1所示。

表1批内精密度试验结果

2.3批间精密度试验：取同一份血清在不同的5张凝胶板上:分别电泳，扫描求得结果。分别计算平均值(`χ)，标准差(s)，变异系数(CV)。如表2所示。

2.4参考范围的确立：取份正常人的血清，进行血清蛋白电泳，计算均值(`χ)，标准差(s)，确立参考范围。清蛋白：53.1％～70.3％α1-球蛋白：0.9％～3.5％；α2-球蛋白：3.5％～8.9％；β-球蛋白：7.1％～14.3％；γ-球蛋白：13.0％～25.4％。

表2批间精密度试验结果

3、讨论

应用现有技术方法所配制的琼脂糖凝胶电泳板，其厚度往往超过3mm，不仅影响蛋白质迁移率，还影响染色效果，因为胶板太厚染料不易渗透进去，蛋白质条带往往形成空泡，对扫描定量结果直接造成影响；另外，脱色时间也很长，且不易脱色干净。此外，经典的加样方式是通过齿状加样模具在胶板上留下凹槽来加样，会导致电泳胶板破损，无法使用。针对现有技术存在的上述问题，本研究提供了一种超薄型琼脂糖凝胶电泳胶板的制备方法并用于分离血清蛋白。与现有技术相比，本研究采用自制的塑料薄板作为模具，所制备的琼脂糖板厚度为小于0.8mm，电泳通电顺畅，染色时间缩短，且染色完全，脱色时间极短，蛋白质分离的分辨率很高，且与加样薄膜配套使用，操作更简便，点样效果极佳。本法模具的材料易获得，成本低廉，制作简单，电泳操作简单，分离效果好。显色干燥后的胶片可长期保存。

血清蛋白电泳实验可将血清中的蛋白质分离为清蛋白、α1-球蛋白；α2-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白，是了解患者血清蛋白质全貌的有价值的方法，可用为初筛实验。如急性炎症或急性时相反应时常以α1、α2：区带加深为特征；肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现清蛋白下降，α2、β球蛋白升高；缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高，而慢性肝病或肝硬变呈现清蛋白显著降低，γ球蛋白升高2～3倍，示免疫球蛋白多克隆高，甚至可见β-γ桥，还可在γ区呈现细而密的寡克隆区带；单克隆免疫球蛋白异常症(M蛋白血症)则在电泳区带α-γ区呈现致密而深染，高度集中的蛋白克隆增生区带(M蛋白区带)。因此，分析血清蛋白电泳分离图谱，有助于对疾病的正确诊断，其应用前景十分广阔。

君意电泳”可提供琼脂糖水平电泳实验所有仪器，如有需要，敬请电话咨询，“君意电泳”，为您的电泳实验保驾护航！

声明：版权归作者所有。因未能找到作者和原始出处，还望谅解，如原作者看到，欢迎联系认领（可发邮至dy