免疫学及免疫学考点必备2015年自考内

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补体结合试验分属三个系统：1、反应系统，包括已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）；2、补体系统、3指示系统，包括绵羊红细胞和相应抗体。

5、直接补体结合试验的原理

若反应系统中抗原与抗体特异结合，形成的抗原--抗体复合物能将同时加入的补体激活，消耗掉补体。当再加入指示系统时，反应液中已无游离ut，不出现溶血，为补体结合试验阳性，待检标本中含有已知抗原（或抗体）相应抗体（或抗原）。反之，为补体结合试验阴性。

血清标本遇有抗补体想象是，可用系列方法处理：1、加热提高1-2℃；2、-20℃冻融后离心去沉淀；3、3mmol/L盐酸处理；4、白陶土处理；5小白鼠肝粉处理

6、酶免疫技术

均相法：是利用Ab-E与Ag结合形成Ag-Ab-E复合物后，标记物失去其特性，如需进行Ag-Ab-E与Ab-E的分离，就可以直接测定游离的Ab-E量，从而推算样品中的Ag量，这种方法称为均相法，通过检测标记酶活性改变，而确定Ag/Ab的含量，用于小分子激素，求半-Ag测定。

7、ELISA的基本原理是：（重点）

抗原或抗体吸附固相载体的表面，并保持其免疫活性；2、抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，任然保持其免疫活性和酶催化活性，测定时，待测的抗体或抗原和酶标抗原或抗体按一定的步骤与固相抗原或抗体反应；3、加入酶的底物，酶催化底物生成有色产物，有色产物的量与样品中待测抗体或抗原的量呈一定比例，通过定性或定量测定有色产物量，即可确定样品中待测物质含量。

8、ELISA测定常用的方法：（重点）

1、双抗体夹心法2、双位点一步发3、间接法4、竞争法5、捕获法6、双抗原夹心法7、中和法

双位点一步发（原理）1、单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体；2、采用高亲和力单克隆抗体可提高测定的敏感性和特异性；3、标本中抗原过量时可出现钩状效应

优点：不但操作简便、时间缩短，而且敏感性和特异性得到显著提高。钩状效应：即类似于沉淀反应中的抗原过剩的后带现象。待测抗原浓度相当高时，抗原分别与固相抗体、酶标抗体结合，不形成夹心复合物，使结果偏低，严重时可出现假阴性结果。

竞争法：（重点）原理：可用于测定抗原，又可用于测定抗体。结合与固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比，结果：参考管或阴性对照管中结合的酶标抗原量最多，颜色最深。

捕获法：（重点）用于检测特异性的IgM抗体，在临床主要是用来检测核心抗体的原理和应用ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(AP)。四甲基联苯胺（TMB）是HRP常用的供氢体，TMB经酶作用后由无色变为蓝色，目测对比鲜明，加酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长nm。

比例法：一般以A/A0≥2.1（A:样品吸光度值，A0阴性对照吸光度值）表示，但阴性对照吸光度值必须大于0.05，若低于0.05，则以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判断标准（此公式只适用与非竞争法）

酶免疫组织化学技术（EIHCT）最常用的酶是HRP，供氢体是二氨基联苯胺（DAB）

9、荧光免疫技术

荧光的猝灭是指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。藻红蛋白（PE）和异硫氰酸荧光黄（FITC）可以公用nm激发光荧光免疫显微技术标本的制作：1、要求标本片尽量薄些。2、力求标本保持抗原的完整性标本的固定剂：最常用的是丙酮和乙醇制备好的标本片，最好立即进行荧光染色检查，如确需保存，应封装保持干燥，置-20℃一下保存。

10、荧光抗体染色常用的方法

直接染色法和间接染色法，直接染色法

原理：是最简单和最基本的染色方法，即将特异性荧光抗体直接加固定的特检抗原标本上，使之与相应抗原结合，以鉴定未知抗原。

评价：本法优点是渐变快速、特异性高，但敏感性较差，不能用已知抗原检测未知抗体，而且为检查多种抗原需准备多种特异性荧光抗体。

11、间接染色法：

原理：染色分两步,首先是未标记抗体（即第一抗体）与抗原反应，然后是标记的抗球蛋白抗体（即第二抗体）与第一抗体反应。

应用：用来鉴定未知抗原或未知抗体，本法又称双抗体法，用一种荧光标记的抗球蛋白抗体，能检查多种抗原抗体的复合物，评价：其敏感性较高，但方法较繁琐，非特异性干扰因素也相对较多。

荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处有三：即光源、滤板以及聚光器

滤板按其作用分为：隔热滤板、激发滤板和吸收滤板，隔热滤板，因能阻断红外线的透过而隔热，时间分辨荧光免疫测定的。

基本原理：以镧系元素铕（Eu）螯合剂作荧光标记物，利用其长唱歌寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。

特点：TRFIA（时间分辨荧光免疫测定）具有较高的灵敏性和特异性①荧光衰变期长；②激发光和发射光之间有很大的位移；③激发光波范围较宽，发射光波范围较窄

12、放射免疫技术

放射免疫分析的基本原理是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体的竞争结合反应。待测Ag量与结合的Ag*-Ab复合物（B）成反比，与游离的Ag*（F）成正比，聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质而不沉淀小分子抗原，因此PEG被广泛用于RIA（放射免疫测定法）实验作沉淀剂，免疫放射分析的原理属于非竞争免疫结合反应，用过量的标记抗体（Ab*）与待测抗原（Ag）反应，待充分反应后，除去游离的标记抗体，抗原标记抗体结合物（Ag-Ab*）的放射性强度与待测抗原量呈正比关系，即待测抗原含量越多，则结合物的放射性强度越高，反之则越低。

免疫放射分析（IRMA）的评价。

优点：①敏感度高②特异性高③标记物稳定，标记容易④检测范围较宽⑤稳定性好

缺点：IRMA抗体用量大，且抗体的特异性要求高，只能测定至少有两个结合位点的抗原

13、金免疫技术

直径60nm的胶体金溶液呈蓝紫色

金免疫测定技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫金为结合物而设计的一种以肉眼观察判定、灵敏度较高、简便、快速的定性免疫金染色技术，主要包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验。

斑点金免疫层析试验的应用及评价：1、方法简便、快速。2、该方法只作为定性试验3、该方法灵敏度不及酶免疫测定

14、化学发光免疫分析技术

发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由较低能级的基态跃迁到较高能级的激发态，然后再返回到基态并释放光子的过程。化学发光与荧光的区别是形成激发态分子的激发能不同。

荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光，化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发射的光，辣根过氧化物酶（HRP）在碱性环境中，HRP对鲁米诺和过氧化氢的反应起催化作用。（HRP的底物是鲁米诺），碱性磷酸酶（ALP）的底物是AMPPD，可产生持续稳定的发光。

化学发光酶免疫测定应属于酶免疫测定范畴，测定过程与ELISA相似，仅最后一步酶反应所以底物为发光剂。三联吡啶钌是电化学发光免疫分析的电化学发光剂，电子供体为三丙胺（TPA）。

15、免疫细胞检测技术

外周血液中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。常用密度梯度离心法：在密度为1.±0.g/ml的等渗溶液中进行密度梯度离心。密度梯度离心法从上至下分布为：血浆-单个核细胞-粒细胞-红细胞，淋巴细胞活力的测定，（方法）常用台盼蓝染色。（结果）正常细胞不着色，而死亡细胞呈蓝色。

CD3分子是鉴定T细胞的标记

CD4分子是T细胞的辅助和抑制细胞诱导亚群的表面标记

CD8分子分布在抑制性T淋巴细胞和杀伤性T淋巴细胞表面。

CD3代表T淋巴细胞总数

（重点）细胞免疫测定试验:①T淋巴细胞增殖试验②T淋巴细胞介导的细胞毒试验③T淋巴细胞功能的体内实验检测④结核菌素实验

（重点）T淋巴细胞增殖试验，是检测细胞免疫功能的常用方法。T淋巴细胞增殖试验就是利用特异或非特异的刺激因子，刺激T淋巴细胞使其分化，观察细胞增殖的程度，反映T淋巴细胞群的免疫应答功能。

（重点）体液免疫功能测定：B细胞数量，血清IgG测定，反向溶血空斑形成试验，B细胞增殖实验，B淋巴细胞功能的体内检测：

　　①血清中免疫球蛋白含量测定

　　②血清中血型抗体测定

　　③特异性抗体产生能力的测定

　　B淋巴细胞功能的体外检测：

　　①B细胞产生抗体的能力的测定

　　②抗体生成细胞的测定

　　B淋巴细胞增殖试验

　　①不同刺激物诱发增殖试验

②葡萄球菌诱导试验

16、细胞因子及其受体的测定

细胞因子：是由活化免疫细胞和某些基质细胞分泌的，能介导和调节免疫反应、炎症反应的小分子多肽。

细胞因子的检测方法分为三大类：

①生物学测定法是检测细胞因子某种特定的生物学活性，而无生物活性的细胞因子前体分子均不能用此法检出；

②免疫学测定法是将细胞因子作为蛋白质抗原，用相应的特异性抗体进行测定；此法所测定的是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性并不一定成正比；

③分子生物学测定法是采用分子生物学技术，检测细胞用在相应的DNA、RNA,反映的是细胞因子基因及其表达情况。虽然这三种方法所反映的是细胞因子的不同方面，测定结果也不一定平行，但它们却是相互关联、互为补充的，在实际工作中常需要这些方法的综合分析。一般以活性单位（U/ml）表示

17、免疫球蛋白测定

高Ig血症分两大类：1、多克隆Ig血症（常见疾病：①感染②自身免疫病、肝脏疾病③各种结缔组织病）

2、单克隆Ig血症亦称M蛋白，是由于单株浆细胞异常增生，产生大量的分子结构相同的Ig，属同性质Ig，其理化性质十分均一，常呈现某一类Ig的显著增高，大多在30g/L以上，此类异常增高的Ig多无免疫活性；多发性骨髓瘤、聚球蛋白症、重链病、轻链病和良性单株丙种球蛋白血症等疾病可表现为单克隆Ig增高。一般以白蛋白商值反映血脑屏障功能；14-33为中度损伤。

18、人类白细胞抗原（HLA）分型检测技术

　HLA具体的分型方法包括：血清学分型法、细胞学分型法和基因分型法，目前普遍采用的血清学分型法为微量淋巴细胞毒试验或称为补体依赖的细胞毒试验。能够用此方法检测的抗原有HLA-A、-B、-C、-DR、-DQ。

19、　HLA血清分型法的原理及应用：

（原理）：该方法的原理是带有特异HLA抗原的淋巴细胞在体外与已知型别的一系列标准抗HLA血清结合后，在补体参与下，引起淋巴细胞溶解死亡。死亡细胞的胞膜失去屏障作用而使染料（台盼蓝或伊红）透入细胞内，在倒置显微镜下观察，死细胞呈蓝色或粉红色，未致敏的活细胞则不着色。

（应用）：根据淋巴细胞的存活与否可以判定其表面是否有与标准分型血清中抗体相对应的抗原。HLA-D和HLA-DP位点的抗原需用细胞学方法分型鉴定，故称为LD抗原。

双向混合礼包细胞培养法：

原理：来源于两个不同个体的淋巴细胞在体外混合培养时，如果它们的HLA-D或HLA-DP抗原相同或者相容，则相互刺激作用小，细胞无变化；反之，如果双方HLA-D抗原不相容，则相互刺激作用就大，导致对方淋巴细胞的增殖，增殖的程度与两个体的HLA-D抗原不配合程度成正比。

该方法检测供血者HLA（人类白细胞抗原）抗原系统相同程度。

　20、超敏反应及其检验

　超敏反应是指机体受到同一抗原再次刺激后产生的一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主要表现的异常或病理性免疫应答。Ⅰ型超敏反应主要由特异性IgE抗体介导。

Ⅰ型超敏反应皮肤试验的原理及应用：

原理：当变应原通过皮肤挑刺、划痕、皮内注射等方法进入致敏者皮肤，与吸附在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的特异性IgE结合，导致肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性介质。在20-30分钟内局部皮肤出现红晕、红斑、风团及瘙痒感，数小时后消失。

应用：用于找过敏原，预防药物或病菌过敏

Ⅳ型超敏反应皮肤试验的原理及应用：

原理：用皮内注射、皮肤斑贴等方法使变应原进入已致敏机体，体内致敏T细胞再次接触相同变应原后，释放多种细胞因子，造成局部以单核细胞和淋巴细胞侵润为主的炎症反应。

应用：用于寻找过敏原，可判断变应原是否引起机体Ⅳ型超敏反应或机体的细胞免疫功能状态。斑贴试验主要检测Ⅳ型变态反应。

皮肤试验出现假阳性的常见原因有：①试验溶液配制不当，过酸或过碱②被试者皮肤反应性过强，如有皮肤划痕症③试验抗原变质或试验抗原不纯④浓度过大.

皮肤试验出现假阴性的常见原因有：①试验抗原浓度过低②患者皮肤反应较低③患者近期内使用过大量抗组胺类药或正使用免疫抑制剂等药物，皮肤试验的应用与评价：防治超敏反应性疾病的重要原则只有是找出相应变应原，避免再次接触，预防药物或疫苗过敏。

评价机体细胞免疫功能状态（Ⅳ型超敏反应皮肤试验既可反映机体是否对试验抗原的致敏状态，同时也反映了机体的细胞免疫功能状况）。

传染病的诊断：

IgE是介导Ⅰ型超敏反应的抗体，检测血清总IgE和特异性IgE对诊断Ⅰ型超敏反应性疾病及确定其变应原均具有重要意义

一般选用敏感性较高的放射免疫测定法、酶联免疫测定法和化学发光法对血清总IgE进行检测。

放射免疫吸附试验（RIST放射变应原吸附试验（RAST）

Ⅰ型超敏反应性疾病，如变应性鼻炎、哮喘、特发性皮炎、湿疹、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、寄生虫感染、急慢性肝炎和IgE型多发性骨髓瘤等均可使血清IgE水平升高。

Ⅲ型超敏反应的主要实验是：聚乙二醇沉淀试验，聚乙二醇沉淀试验的原理及评价：

原理：聚乙二醇（PEG）是一种不带电荷的直链大分子多糖，有较强的脱水性，用3%-4%浓度的PEG可选择性地沉淀大分子CIC（循环免疫复合物）

评价：聚乙二醇沉淀法简单易行，容易普及，但敏感度不高，容易受多种大分子蛋白和温度的干扰，特异性差。

21、免疫预防与计划免疫

亚单位疫苗：是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。

基因工程疫苗有：重组抗原疫苗重组载体疫苗DNA(RNA)疫苗，转基因植物疫苗，疫苗的基本特征：①安全灭活疫苗菌种为致病性强的微生物，应予彻底灭活；活疫苗的菌种要求遗传性状稳定，无返祖，无致癌性；血液制品，确保血液不含病原体；应尽可能减少副作用。②有效：疫苗接种后应既能引起体液免疫，又能引起细胞免疫，而且维持时间长。③实用：应尽可能简化接种程序，同时应无不适反应，易于保存、运输、价格低廉。

22、动植物病原体的免疫学检验

口蹄疫（FMD）病毒有7个血清型，在OIE/FAO的世界口蹄疫参考实验室（WRL），监测口蹄疫病毒抗原和病毒血清型的优选方法是ELISA方法，是一种间接夹心法，检验禽流感常用的免疫学方法为琼脂免疫扩散试验（AGID）。

23、健康相关产品的免疫学检验

“环境激素”概念：主要以苯环为基本骨架的各种多环、杂环类物质，它们是并不直接毒害生命，但以“激素”面貌对生物体发生作用。即使含量极少，也会使生物体内的内分泌失调、生殖系统畸形。化妆品安全性评价的免疫学检验：常用人体斑贴试验，增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力。

24、免疫学检验的质量控制

注意严重溶血对检测结果的影响，注意细菌污染对监测结果的影响，对标准品及质控品的要求：1、与被测定物有相同的特性，活性稳定2、物理性能均一，没有细菌污染3、所用基质对测定结果无明显影响4、无生物传染危险性。

定性的免疫检验方法：主要有沉淀实验、凝集实验、荧光免疫实验和酶免疫实验等

此类测定的质控要点是（定性）：把握测定下限，应选择浓度接近试剂盒或方法测定下限的质控品进行质量控制

定量的免疫检验方法：主要有放射免疫实验、酶免疫实验和化学发光免疫实验

（定量）：室内质控应选择特定试剂盒或方法测定范围内高、中和低三种浓度的质控品

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