CART细胞治疗拓展到实体肿瘤的探索经

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本文转自博生吉细胞研究

摘要

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是一种结合分子生物学和细胞疗法，来达到精准治疗的一种独特的平台技术，目前在在急性淋巴细胞白血病（ALL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）、多发性骨髓瘤（MM）等血液学恶性肿瘤患者中显示出前所未有的治愈率。随着两款靶向CD19的CAR-T细胞（Kymriah，Yescarta）被FDA批准用于治疗B-ALL和DLBCL，CAR-T细胞治疗技术正在向综合治疗方案以及其他恶性肿瘤适应症方向探索。然而，尽管在血液学恶性肿瘤方面取得了令人印象深刻的结果，但在一些实体肿瘤临床前研究中却显示CAR-T细胞疗效有限。尽管到目前为止还没有临床研究结果显示CAR-T疗法可以很好地扩大到ALL/NHL/MM以外的适应症，这些尝试也让我们更好地了解了CAR-T治疗在实体瘤方面特有的迫在眉睫的挑战。本文阐述了作者目前对CAR-T细胞疗法作用机制的理解，同时指出了在实体肿瘤中CAR-T细胞治疗的主要局限因素。作者分析了最近的一些研究，并提出了一些新的潜在策略，以克服CAR-T细胞在实体肿瘤治疗方面所面临的挑战。

引言：CAR-T细胞的历史与机制综述

在过去的一年，CAR-T细胞作为血液学恶性肿瘤的有效治疗手段取得了显著进展。CAR-T细胞疗法在体内的作用机制也遵循Chen和Mellman提出的免疫循环：肿瘤细胞抗原释放?抗原呈递?APC以及T细胞活化?浸润到肿瘤环境?识别肿瘤细胞并产生细胞毒性效应。在FDA批准CD19靶向CAR-T细胞药物（表1）前后，多个研究机构发表了关于复发/难治性B-ALL、大B细胞淋巴瘤（LBCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）的临床试验研究结果。然而，迄今为止，研究者尚未发现CAR-T细胞在实体肿瘤中临床活性的相关证据。

CAR-T细胞的制备：首先从患者身上分离出外周血淋巴细胞，然后选择性的扩增其中的T细胞。一般来说，T细胞可以在10-42天内扩增-0倍[7,8]。靶向目标抗原（CD19）的基因序列，将在扩增过程的早期被插入T细胞。随后，T细胞将在细胞表面表达CAR分子，结构上包括胞外抗原结合域、跨膜锚定域和细胞内信号域（图1）。

▲图1.经典的第二代CAR-T结构以及与肿瘤细胞的识别方式。

与缺乏任何共刺激信号的第一代CAR-T细胞不同的是，第二代及以后的CAR-T细胞将共刺激信号，如CD27、CD28、CD和CD（4-1BB）包含在基因构建中，这样可以产生更有效的CAR-T细胞。第二代CAR-T细胞有一个共刺激信号域，第三代CAR-T细胞有多个共刺激信号域。在数周的时间内，通过使用CD3抗体、刺激性细胞因子和/或抗原呈递细胞（aAPC）等手段来扩增CAR-T细胞。然后将扩增的CAR-T细胞输回患者体内，通过外周循环（血液循环、淋巴循环）运输，最终识别并结合肿瘤细胞外的靶抗原（图2）。

▲图2.CAR-T细胞的治疗流程。

一旦与靶抗原（CD19）结合，CAR-T细胞的细胞毒性机制将被激活，发生抗肿瘤反应（图3）。

▲图3.CAR-T细胞的抗肿瘤反应机制。

研究发现，在输注CAR-T细胞之前，进行清淋预处理可以有效的增强CAR-T细胞在体内活性和持久性[9]。表1总结了年至年期间进行清淋预处理的部分早期临床试验的结果。

▲表1.-年期间部分CD19-CAR-T临床试验结果。

将T细胞作为一种治疗恶性肿瘤的手段的演变包括几个阶段，每个阶段都影响了了CAR-T细胞的治疗方法和制备过程。

①肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）是从实体瘤中获取的，体外扩增后再注入患者体内，这是原理的早期证明，也提供了T细胞在实体瘤中潜在活性的证据[10]。然而，与CAR-T细胞不同的是，TIL的局限性在于它们需要通过主要组织相容性复合体（MHC）识别目标抗原。

②在病毒相关癌症中，细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在治疗EB病毒和巨细胞病毒相关癌症方面已被证明是有效的；但与TIL一样，CTL的局限性也在于它们需要通过MHC识别目标抗原，同时他们面对同样一个障碍：部分肿瘤含有MHC基因突变[11]。

尽管这些迭代的抗肿瘤T细胞疗法均在治疗实体肿瘤方面做了诸多的努力，但是却没有取得显著的成功；但在血液学恶性肿瘤领域，CAR-T细胞治疗却得到了巨大的成功。

血液学恶性肿瘤细胞（如B细胞恶性肿瘤）分散存在于整个外周循环，其细胞外抗原（如CD19）只特异性表达在B细胞表面，已被证明是CAR-T细胞的理想靶点。Carl.HJune等人最早报道了这项技术的显著的临床疗效[12]。

在该项研究中，研究者使用慢病毒载体在T细胞表面表达CAR，结构包括B细胞表面抗原CD19的单克隆抗体序列，CD（4-1BB）共刺激域和CD3zeta结构域（T细胞受体的信号转导成分）。在难治性CLL患者中，CAR-T细胞在回输到患者体内后可以扩增到初始输入水平的0倍以上，导致完全缓解，治疗后持续10个月。反应伴随着肿瘤溶解综合征、3/4级淋巴细胞减少和低丙种球蛋白血症的发生，而CAR-T细胞在血液和骨髓中持续高水平存在达6个月。

年，FDA先后批准Kymriah与Yescarta用于治疗复发/难治性B-ALL以及大B细胞淋巴瘤，同时批准了托珠单抗用于干预治疗过程中的细胞因子释放综合征（CRS）。CAR-T细胞的巨大成功目前已经拓展到MM患者。最近Brudno等人[13]发表的一项人体临床试验中，16例难治性MM患者接受了表达抗B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR-T细胞治疗。研究总有效率（ORR）为81%，63%的患者达到了vgPR或CR，中位无病生存期达到31周。有反应的患者表现出很高的血BCMA-CAR-T细胞峰值，这与抗MM反应是相关的。某些情况下可能出现严重的CRS毒性，但通常是可逆的。然而，事实证明，在实体恶性肿瘤中使用CAR-T细胞治疗很困难，部分原因是实体肿瘤相关的肿瘤细胞标记物的异质性表达。这一障碍将是未来一个主要的研究领域，也将成为癌症靶向治疗的下一个主要促进因素。CD19是CAR-T细胞治疗领域的一个关键的靶点；然而，现在也有充分的证据表明其他一些靶点的有效性（图4）。

▲图4.一例BCMA-CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤的PET-CT结果。

细胞因子释放综合征

CRS是CAR-T细胞治疗相关的最主要的不良事件。症状通常包括发烧、心动过速、肌痛和低血压，随后出现器官系统功能障碍；心血管、呼吸、神经、肝脏和肾脏系统紊乱[14]。虽然CRS并非仅仅出现在CAR-T细胞治疗中，但它体现了T细胞与预期靶细胞深入接触后的直接结果[15]。CRS由多种细胞因子介导，包括：白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、IL-2、IL-5、IL-8、IL-10、GM-CSF，这些是T细胞攻击恶性CD19+B细胞后的直接结果[16,17]。了解和更好地控制CRS将是CAR-T治疗扩展到血液学恶性肿瘤之外的适应症的重要考虑因素。

在年公布的的一项多中心II期临床试验中，名复发/难治性B细胞淋巴瘤患者接受了Yeacarta治疗，93%的患者发生了与CRS相关的不良反应[3]。同样，在一项年公布的一项单中心I-IIa期临床试验中，75名接受Kymriah治疗的复发/难治性B细胞ALL患者中，77%的患者发生了与CRS相关的不良反应[2]。

较高的肿瘤负荷是否与CRS有关目前仍然存在争议。通常的观点，IL-6由于其促炎作用被认为是CRS的主要介导物[16]。而且，被CAR-T细胞靶向和攻击的肿瘤负荷越高，循环中IL-6水平越高[16]。然而，Teachey等人的研究[15]表明，在CAR-T细胞治疗前是否有更高的疾病负荷，不能预测是否会出现严重的CRS。

CRS的临床表现

CRS的临床表现包括：1.体质症状，如发热、寒战、头痛、疲劳、肌痛、关节痛、背痛和腹痛、厌食、恶心、呕吐；2.与特定器官功能障碍，特别是心血管、呼吸、神经、肾脏、免疫、胃肠和肝脏系统相关的发现；3.血液和电解质测试异常，包括低钾血症、高尿素、肾小球滤过率降低和高C反应蛋白（CRP）[16,18]。研究发现，CRS的进展始于发烧，然后引起全身症状（如低血压、呼吸窘迫）和神经系统症状（如头痛、困惑、幻觉和癫痫发作）[19]。CRS表现可在CAR-T细胞输注后数小时内看到。

CRS支持性护理一般包括抗菌预防，和/或托珠单抗治疗，和/或皮质类固醇（激素）的使用[16]。

有趣的是，年Ding等人在一起案例报告[19]中描述了一种局限于胸腔的CRS，这与CD19-CAR-T细胞疗法治疗后的通常发生的典型全身CRS不同。患者被发现有持续性咳嗽和双侧胸腔积液；胸膜液的分析显示IL-6和CAR-T细胞的水平相对于血液水平显著升高。这例局部性的CRS，应当作为CAR-T细胞治疗将来临床应用的一项重要考虑，尤其在实体肿瘤的治疗中。

CRS的追踪

尽管特定细胞因子（如IL-6）在CRS中的作用众所周知，但用血液中的IL-6水平指征CRS进展状态仍然具有一定的挑战性（实验室检测方法的局限性）。相反，CRP（一种常用的炎症标志物）的敏感性为86%，特异性为%，可以用于确定严重CRS的风险，其特征是持续至少3天的发热和细胞因子水平的增加，同时包括以下其中一项：低血压（需要血管加压剂）、缺氧（PO%）或神经系统紊乱[17]。同时，CRP还可用于确定整个过程中CRS临床表现峰值的时间点[16]。

尽管如此，作为非特异性的炎症标记物，在CAR-T治疗中，CRP升高的水平必须确定来源于CRS反应还是感染过程，因为CAR-T细胞治疗对B细胞的全面清除会带来全身性免疫抑制状态[16]。然而，在进行血清细胞因子和生物标志物的分析后，Ceulee等人却表示CRP不能有效地用于预测严重的CRS[15]。相反的，该研究小组发现，可溶性糖蛋白（sgp）和γ干扰素水平更能预测后期产生的严重CRS，严重CRS患者通常会出现γ干扰素、IL-6和可溶性IL-2受体α明显增加，这些患者一般会发生代偿性休克或呼吸困难。尽管这些发现暗示某些细胞因子对CRS的预测价值，这些研究小组也承认完成这些细胞因子的实时监测存在难度。

CRS分级

在CAR-T细胞治疗的过程中，对CRS进行分级在鉴别和干预综合征中发挥了重要作用。1.年，MDACC的Lee等人[16]扩展了NCI的CTCAE4.0版系统，重点